样本前处理

PBMC 提取注意事项

PBMCs 应在采集血液样本的 8 小时内制备，以保存细胞功能。如果样本无法在 8 小时内准备:

1、在室温(不是 4 摄氏度)，立即稀释血样。有助于减少粒细胞污染。例如，在 RPMI 或 PBS 中 1:1 稀释。

2、通过交联红细胞和颗粒细胞去除颗粒细胞，然后使用 FicollTM 从 PBMC 分离。(缺点:部分 PBMC 可能丢失)。市面上也有这方面的试剂盒。

3、在环境温度下装运新鲜样品。注意，运输温度可以低于 4℃。市面上有可以将样品保存在环境温度下的容器。

4、样品的冷冻应优化。尽可能使用无血清培养基(血清中含有丝裂原和可能影响结果的抑制剂)。

样本要求

1、活性至少是70%（质控标准）

2、96孔培养，每孔细胞数需要至少105细胞，每孔每样本

3、现阶段仅细胞：冻存细胞、新鲜全血、新鲜提取的PBMC

样本取材和运输

预处理运输条件

1、上海送出样本

全血紫色抗凝管收集（肝素抗凝），上下混匀，当天送到实验室4°运输。

细胞样本消化分离收集，PBS清洗一次，重悬于PBS/培养基中，当天送达实验室4°运输。

2、其余地点送出样本

全血提取PBMC，按照正常冻存操作冻存PBMC 干冰运输。

细胞样本按照正常冻存操作冻存细胞干冰运输。

制备小鼠脾脏样本

1、组织研磨：用无菌不锈钢轻轻梳理组织，推荐分散到 30ml 培养基中。轻轻上下吹打几次，进一步驱散结块。清除剩余的细胞团块和碎片。

2、在 2000 转/分的转速下将细胞离心 5 分钟，并将细胞颗粒重新悬浮在以下步骤所推荐的培养基中。

密度梯度分离(根据 Ficoll-PaqueTM 说明书)

1、用等量的无菌9%NaCl 或平衡盐溶液(如 PBS 或 HBSS)稀释整个血样。

2、将稀释后的样品置于相当于初始血容量的 Ficoll-Paque RTM 上。注意尽量减少样品和 Ficoll-PaqueTM 的混合。

3、在室温下 2400rpm 离心 20 分钟。

4、从 Ficoll-PaqueTM 与等离子层的接口上取下 PBMC。

5、用9%的无菌 NaCl 洗涤富集细胞，离心 2 次，每次 5 分钟，2000 RPM，然后在 3000 RPM 下离心 8 秒，去除血小板。

6、调整 ELISPOT 程序推荐的培养基中的细胞密度。

冷冻细胞储存（快速冷冻会损害细胞）

1、细胞培养基中含 20%的 DMSO。保持在冰上。

2、标记冷冻管。

3、在冰冷的培养基中以 40×106 细胞/毫升的浓度重新悬浮细胞。保持在冰上。

4、将5 mL 细胞悬浮液放入冷冻管中。将 20% DMSO 按 1:1 的比例轻轻加入细胞悬浮液中。最终的悬浮液浓度为 20x106 cells/ml。

5、立即将冷冻管放入冷冻容器中。

注：在一系列 ELISPOT 实验中，从一个好的供体中冷冻大量的细胞样本作为对照，是检查结果标准化的有用工具。

解冻冷冻细胞用于 ELISPOT 试验

1、在 37 摄氏度的水浴或烧杯温水中迅速解冻细胞。任何时候都不要涡旋细胞。

2、轻轻地将细胞转移到含有 15ml 培养基的 50ml 试管中(每 50ml 试管含有5-5.0 mL 细胞)

3、向试管中注入 50 毫升培养基。轻轻翻转管子搅拌。

4、旋转细胞 1200 转/分 5 分钟。

5、倒出上清液，轻轻弹管重新悬浮颗粒。在适当的培养基中计数和调整细胞到所需的密度。

6、细胞现在已经准备好用于 ELISPOT 试验。

运输条件

温度：干冰运输

细胞数量：每个样本需要 10 的 5 次方 ，活性不低于 70%

样品标记：编号尽量简单 1-2-3-4……