样本前处理

1、PBMC提取

(1)  取15ml离心管若干。

(2)  向每个离心管中加入2ml Ficoll（人：1.077；鼠：1.084）。

(3)  用PBS与外周血1：1混合。

(4)  将离心管倾斜30°，向加入Ficoll的离心管中缓缓加入用2ml 稀释后的外周血。

(5)  2000rpm离心20min，升5（加速）降0（降速）。

(6)  离心后可看见管内分三层，上层为血浆和PBS，下层主要为红细胞和粒细胞，中层为淋巴细胞分离液。在上、中层界面出有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，即白膜层。（单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞）。

(7)  取白膜层细胞于新的离心管中，加入10mlPBS，1500rpm离心10min，正常升降（升7降7）。

(8)  弃去上清，用PBS重悬细胞继续后续实验。

2、肺脏组织-小鼠

(1)  先溶解小鼠肺脏解离试剂盒（130-095-927）: 用去离子水稀释Buffer S至1X,用3mL 1X Buffer S溶解酶D，用1mL Buffer  S溶解酶A，不涡旋，-20℃保存。

(2)  配置酶MIX：2.4mL 1X Buffer S + 100uL酶D+15uL酶A，。

(3)  将组织取出后用PBS漂洗，切成2-4mm块状，转移到含2.5 ml酶mix的C Tube中。

(4)  拧紧管盖，置于解离仪上，选择相应的运行程序，程序运行完成后，将C Tube取下，将所有的样本过细胞滤网，收集细胞计数，根据计数结果，进行后处理，包括：去红细胞处理、去死细胞处理、去碎片处理，直至达到染色要求。

3、脑样本-鼠

(1)  用1mL Buffer A溶解酶A，不涡旋，-20℃保存。

(2)  配置酶混合液：1900 ul buffer Z+50 ul 酶P+20 ul buffer Y+10 ul 酶A,对应500mg以下样本。

(3)  用预冷的D-PBS清洗样本，将样本剪成0.5 cm块状，转移至C管中，加入1980ul混合酶液，盖紧C管，按照样本质量选择相应的程序。

(4)  解离结束后，用10ml预冷的D-PBS清洗C管，用70um滤网过滤，离心 300g，10min。

(5)  按照样本质量加入选择相应的富集方案，离心 3000g，10min。

(6)  离心结束后，去掉最上面2层，重悬沉淀，用D-PBS补满体积，离心 1000g，10min。

(7)  离心结束后，倒掉上清，收集细胞沉淀。

4、肿瘤样本-人

(1)  先溶解人肿瘤解离试剂盒（130-095-929 ）: 用3mL1640或DMEM溶解酶H，用2.7mL1640或DMEM溶解酶R，用1mL Buffer A溶解酶A，不涡旋，-20℃保存。

(2)  配置酶MIX：2.2mL1640或DMEM + 100uL酶D+50uL酶R+12.5uL酶A，每份样本为0.05-0.2g，对应2.5mL酶mix。

(3)  将组织取出后用PBS漂洗，去除脂肪组织、纤维组织和坏死区域，将肿瘤目标区域切成2-4mm块状，转移到含酶mix的C Tube中。

(4)  拧紧管盖，置于解离仪上，根据肿瘤的质地选择运行程序，程序运行完成后，将C Tube取下，将所有的样本过细胞滤网，收集细胞计数，根据计数结果，进行后处理，包括：去红细胞处理、去死细胞处理、去碎片处理，直至达到染色要求。

5、肿瘤样本-小鼠

(1)  先溶解小鼠肿瘤解离试剂盒（130-096-730）: 用3mL1640或DMEM溶解酶D，用2.7mL1640或DMEM溶解酶R，用1mL Buffer A溶解酶A，不涡旋，-20℃保存。

(2)  配置酶MIX：2.35mL1640或DMEM + 100uL酶D+50uL酶R+12.5uL酶A，每份样本为0.04-1g，对应2.5mL酶mix。

(3)  将组织取出后用PBS漂洗，去除脂肪组织、纤维组织和坏死区域，将肿瘤目标区域切成2-4mm块状，转移到含酶mix的C Tube中。

(4)  拧紧管盖，置于解离仪上，根据肿瘤的质地选择运行程序，程序运行完成后，将C Tube取下，将所有的样本过细胞滤网，收集细胞计数，根据计数结果，进行后处理，包括：去红细胞处理、去死细胞处理、去碎片处理，直至达到染色要求。

6、脾脏/淋巴结样本

(1)  在50ml离心管上放置70um滤网，使用1X PBS润湿 。

(2)  使用冷的 PBS 缓冲液清洗组织，将其转移到提前润湿的滤网上，使用被1X PBS润湿的研磨棒进行研磨，研磨期间多次使用冷的 PBS冲洗研磨棒和滤网，研磨结束后，使用5ml 1X PBS冲洗研磨棒和滤网。

(3)  离心 3-500g，5min，收集细胞计数，根据实验要求进行后续处理。

7、血样样本

(1)  先配置1X Lysing Buffer工作液: 用去离子水 9：1 稀释10X BD Pharmingen Lyse™ Lysing Buffer (货号：555899)，每份样本需要 1ml Lysing Buffer 工作液。如  10 个样本需 1ml 10x Lysing Buffer和  9ml 去离子水 ）。1X Lysing Buffer可在 2-8°C 保存一周。

(2)  根据实验所需，每200ul的血液，加入1ml的1X Lysing Buffer工作液，反应10分钟，离心 3-500g，5min，去上清（如果存在大量未裂解完成的红细胞，请重新再次裂解，时间适宜），加入1ml PBS ，重复洗2遍，最后1ml PBS 重悬。

8、细胞表面染色

(1)  使用冷的 PBS 缓冲液洗细胞两次，再用 1X PBS缓冲液制成 1X 10 6 细胞/ml 的悬液。

(2)  设置流式Blank、补偿对照以及样本管。

(3)  各组依说明书加入适量的FC block，2-8°C 避光孵育 10 分钟，随后加 1ml PBS清洗细胞，离心 3-500g，5min，1ml重悬。

(4)  各组依说明书加入适量的死活染料，室温避光孵育15 分钟，离心 3-500g，5min。随后加 1ml Stain Buffer（554656）清洗细胞，离心 3-500g，5min，100 µl重悬。

(5)  各管依说明书加入适量的细胞表面荧光抗体，2-8°C 避光孵育 30 分钟/常温避光孵育 15 分钟。随后加 1ml PBS清洗细胞，离心 3-500g，5min。

9、胞内因子染色

(1)  表面染色之后，加入 1ml的stain Buffer工作液清洗一次。

(2)  各组加入 250ul的TF Fix/Perm Buffer工作液，4°C孵育 25分钟。

(3)  加入stain Buffer工作液将体积补足至1ml，离心弃上清，加入1ml的1 X Perm/Wash Buffer工作液清洗细胞2 次，200µl重悬。

(4)  胞内染色， 4°C孵育 30 分钟。

(5)  向管中加入1ml PBS清洗细胞，离心 3-500g，5min，400 µl重悬，3小时内上流式细胞仪。

10、核内因子染色

(1)  表面染色之后，加入 1ml的stain Buffer工作液清洗一次。

(2)  各组加入 1ml的TF Fix/Perm Buffer工作液，4°C孵育 45分钟。

(3)  离心弃上清，加入1ml的1 X Perm/Wash Buffer工作液清洗细胞2 次，200µl重悬。

(4)  核内染色，4°C孵育 30 分钟。

(5)  向管中加入1ml PBS清洗细胞，离心 3-500g，5min，400 µl重悬，3小时内上流式细胞仪。

注意事项：

1. Ficoll使用时的温度很重要，温度太高或者太低都会影响分离效果，Ficoll提前半小时从4℃冰箱取出恢复到室温，温度过高会导致分离不明显，温度过低会导致密度过大，同样分离效果不好，20~25℃最佳。
2. 血液样本最好为新鲜抗凝血（采血2 h 以内），为保持细胞活力，应避免冷冻和冷藏。
3. 50 mL离心管离心效率比15 mL离心管差，为了获得最大量的单核细胞，最好用15 mL离心管，且离心管使用量不要超过三分之一，可以将血样进行等分后加入多个离心管。
4. 如果细胞要再培养，采用无菌操作和不含叠氮化物的缓冲液进行所有步骤。

运输条件

样本处理视频

Ficoll分离人外周血单个核细胞：https://www.u-labex.com/article-6079.html