亨廷顿病（HD）是一种单基因神经退行性疾病，由亨廷顿（HTT）基因中CAG三核苷酸重复结构域的扩增引起，导致HTT蛋白中的聚谷氨酰胺（polyQ）延伸。这种突变体HTT（mHTT）蛋白极易发生细胞内聚集，导致纹状体、皮层和大脑其他区域的严重损伤和细胞丢失。因此，调节这些脑区的mHTT水平以降低细胞内mHTT和聚集水平是HD治疗学发展的直接途径。

为此，可用于检测生物样本中HTT水平变化的分析是评估靶参与和指导临床试验剂量选择的宝贵工具。基于Meso Scale Discovery（MSD）ELISA （超敏多因子电化学发光分析仪：SQ120 & S600）的检测平台是一种稳健、灵敏的方法，以前用于定量HTT。然而，目前可用的HTT MSD分析主要是检测蛋白质的单体可溶性形式，而不是聚体。
 
在这项研究中，描述了新的MSD分析方法的发展，该方法优先检测聚体形式的mHTT。重组单体HTT（1–97）-Q46以时间依赖性的方式形成聚体，用于表征每个已建立的分析在更高组装状态下区分HTT单体和HTT的能力。使用来自R6/2、zQ175敲入和BACHD小鼠模型的脑裂解物对这些分析进行进一步验证，以复制先前具有良好特征的脑聚集信号的年龄依赖性增加，以及使用CAG定向等位基因特异性锌指阻遏蛋白（ZFP）敲除mHTT后纹状体聚集水平的显著降低。
 
最后，使用尺寸排除色谱法从脑组织裂解物中分离和表征HTT，以证明含有聚集HTT的组分的分析的特异性。总之，证明新开发的分析方法优先检测聚集的HTT，与以前的分析技术相比，性能有所提高。这些分析补充了现有的针对可溶性HTT单体的MSD平台分析，允许在HD临床前模型中对与疾病相关的HTT物种进行更全面的分析。

在本研究过程中，分析了R6/2、zQ175和BACHD小鼠模型的组织匀浆。这些HD模型动物在表达的mHTT种类和Q-长度方面存在差异。R6/2动物是人类HTT基因5'区域的转基因动物，该区域包含外显子1，在Jackson实验室维持的群体中Q长度约为120，zQ175小鼠产生嵌合全长HTT，其中小鼠HTT的外显子1被人类序列替换，平均Q长度约为198。zQ175小鼠还表达由不完全剪接产生的小聚腺苷酸化mRNA编码的外显子1 HTT。我们的尺寸排除色谱数据显示，在16毫升的洗脱液中有一个峰，与外显子1 HTT单体的存在相一致。BACHD小鼠表达Q长度为97的人类全长HTT。聚集分析中，对这三种小鼠模型的年龄序列的分析表明，聚体的形成取决于整体结构长度和polyQ长度。在R6/2小鼠中检测到最高信号，因为外显子1 HTT非常容易聚集。与R6/2小鼠相比，hetQ175小鼠中最老动物的聚集水平大约低5-10倍，这可能与这些敲除小鼠中存在的外显子1 HTT的较低水平一致。在BACHD小鼠中测量到最低信号。这里，考虑到应用的总裂解物浓度，在MW8/4C9-ST分析中，最老动物的信号比hetQ175动物的信号低约100倍。在MW8/MW8-ST分析中，所有样本的信号均低于检测限。hetQ175和BACHD小鼠之间总负荷差异的一个原因可能是hetQ175动物的Q长度显著延长。对于所有三种动物模型，观察到的聚集水平的增加强于伴随的mHTT水平的降低。这可能是由于细胞内产生了新的mHTT蛋白，以补偿已并入聚集体的mHTT分子，并保持恒定水平的细胞单体HTT。
 
本研究发现新的检测方法优先检测聚体形式的HTT，扩展了可用MSD分析技术开发检测的能力，可用于识别和量化HD临床前模型中存在的不同HTT物种。本研究建议所提供的聚集HTT分析与可溶性HTT分析并行使用，以最好地评估HTT蛋白群体，尤其是用于HD模型表征和HTT降低研究的生物样本。

本研究MSD检测方案（基于MSD S600 机型）