这周给大家分享的文章是发表于《nature communication》杂志的“Immune suppressive landscape in the human esophageal squamous cell carcinoma microenvironment”，文章通过单细胞测序、流式、免疫组化等方法加上详细的数据分析，全面分析了肿瘤浸润性免疫细胞的特征，揭示了抑制性免疫状态的概况。

01 、ECSS里免疫细胞的单细胞RNA测序
为了生成人ESCC中免疫细胞的深层转录图，作者对单细胞基因表达程序进行了分析，并从7对新鲜、手术切除的肿瘤和匹配的ESCC邻近组织分离的CD45 +细胞浸润的免疫细胞中进行了TCR测序（图1A）。除去低质量的细胞后，共保留80787个细胞(每个样本3248-9097个)进行进一步分析。在这些细胞中，平均每个细胞检测到1170个基因。
分析样本的临床信息和苏木精伊红(HE)染色结果见补充图1。为了能够对免疫细胞群进行系统分析，作者对所有样品的单细胞数据进行了标准化和汇总，并进行了无监督聚类以识别可区分的种群。成功鉴定了肿瘤浸润免疫细胞的主要类型，包括T细胞，NK细胞，单核细胞/巨噬细胞，树突状细胞（DC），B细胞，浆细胞和肥大细胞，以及与分选后的细胞混合在一起的其他非免疫细胞的极小部分，且经典标志物的表达与结果一致（图1B-D）。
通过比较肿瘤和邻近组织之间CD45 +细胞中每种细胞类型的百分比，作者发现肿瘤中T细胞和单核细胞/巨噬细胞增加，B和NK细胞的百分比降低了（图1E），且不同患者的的肿瘤间的免疫组成存在很大差异（图1F）。T细胞是肿瘤中最丰富的免疫细胞类型，占CD45 +细胞总数的30–71％（1G）。七个样本分为两组，在3对肿瘤-邻近组织样本(S133、S134和S150)中T细胞只占总细胞的不到2%。其他4对肿瘤邻近细胞样本中(S135, S149, S158, S159)，其中总细胞中有6-12%是T细胞（图1H-I）。
作者将ESCC中浸润免疫细胞的主要部位与其他类型的癌症进行了比较。作者发现ESCC属于浸润性T细胞和单核/巨噬细胞较多，浸润性B细胞较少的肿瘤类型(图1J)。这与作者的观察结果一致，即ESCC与相邻组织相比，T细胞和单核/巨噬细胞增多，B细胞比例减少(图1e)。

02 、T细胞和NK细胞的聚集和亚型分析
由于T细胞和NK细胞是TME中主要的细胞毒性免疫细胞，作者对所有样本中的T细胞和NK细胞进行了无监督聚类。鉴定出6个CD4 T细胞簇，7个CD8 T细胞簇，1个CD4和CD8双阴性T细胞簇和3个NK细胞簇，且各个细胞簇中表现出了不同的标记特征（2A-B）。在CD4 T细胞中，CD4-C6-FOXP3具有较强的Treg标志，而CD4-C5-STMN1具有较强的力竭细胞标志。CD4-C4-IFIT3富含细胞毒性特征；CD8-C1-NKG7为活化的细胞毒性CD8 T细胞，而CD8-C5-CCL5和CD8-C6-STMN1的力竭评分低于CD8-C7-TIGIT（2C-D），这一结果表明，大多数肿瘤浸润性CD8 T细胞在ESCC中处于活化，记忆或力竭的状态。
Tregs（CD4-C6-FOXP3）中激活的某些基因与CD4 T细胞（CD4-C5-STMN1）的力竭细胞的特征基因重叠。作者将两个细胞簇的基因表达与幼稚样细胞群（CD4-C1-CCR7）进行了比较。力竭细胞和Treg细胞中都富集的基因包括调节分子和许多共抑制和共刺激受体（2E）。细胞毒性和力竭的CD8 T细胞均表达许多效应分子（2F）。CD8-C7-TIGIT表达高水平的TOX和NFATC2（2G）。这表明CD8-C5-CCL5处于力竭的早期阶段，而CD8-C7-TIGIT处于力竭的阶段，而CD8-C6-STMN1可能是CD8-C5-CCL5和CD8-C7-TIGIT的过渡阶段。然后，作者分析了样本中CD8 T细胞中的CD39表达。结果表明，与其他簇相比，在力竭早期和力竭的CD8 T细胞（C5，C6，C7）中，CD39表达明显更高。此外，除S158以外，大多数CD8 T细胞在肿瘤中表达的CD39均高于邻近组织（2H）。

03、 肿瘤中T和NK细胞的状态改变
作者比较了肿瘤和邻近组织之间的T细胞。与相邻组织相比，肿瘤中Treg细胞簇CD4-C6-FOXP3和CD45 +细胞中力竭的CD4 T细胞CD4-C5-STMN1的百分比显着增加，Treg和力竭的CD4 T细胞占肿瘤中CD4 T细胞总数的50％以上，而在相邻组织中仅占25％（3A-B）。Treg细胞在肿瘤中占比增加（3C）。同样的，力竭的CD8 T在ESCC细胞中富集，PD1的表达在ECSS中增加（3C-F）。相比之下，活化的细胞毒性CD8 T细胞组(CD8-C1-NKG7)显著下降，从邻近组织的23%下降到肿瘤组织的4%(图3E)。肿瘤组织中treg和力竭的CD4和CD8 T细胞显著增加，表明肿瘤存在免疫抑制环境。
与邻近组织相比，作者还观察到肿瘤组织中NK细胞的大量减少（1E）。此外，NK细胞的主要细胞簇在相邻组织中为NK-C1-NCR3，在肿瘤中为NK-C3-KLRC1，并且NK-C2-STMN1在肿瘤中也急剧增加（3G）。NK-C1-NCR3表达高水平的NCR3，CD266，NKG7和LAMP1，NK-C3-KLRC1和NK-C2-STMN1高表达KLRC1和ITGA1抑制受体（3H）。流式结果显示，ESCC NK细胞中NKG2A（KLRC1）表达增加（3I），NK-C3-KLRC1和NK-C2-STMN1具有极低的细胞毒性评分，力竭细胞占比提高（3J），表明NK细胞不足且在ESCC中功能受损。
作者进一步分析了T和NK细胞簇中的细胞周期，以确定细胞的增殖能力。作者发现富含力竭基因的CD4-C5-STMN1，CD8-C6-STMN1和NK-C2-STMN1都具有高度增殖性（图 3K-M），表明力竭的T细胞是主要的肿瘤内增殖免疫细胞腔。

04 、CD4和CD8 T细胞的克隆性
为了确定T细胞的克隆选择和扩增是否导致了所观察到的表型多样性，作者进一步分析了来自相同样本的偶联TCR测序结果。作者观察到总共15654个独特的TCR序列，克隆扩增，克隆大小从2到2600不等。TCR克隆型组成在患者之间变化很大。虽然一些患者显示出最小的克隆扩增（S134，S135和S158），但其他患者则以少量的T细胞克隆（S149和S150）为主导。在S149和S150肿瘤中，65%和68%的T细胞具有两个以上的TCRs，这表明T细胞在这些肿瘤中具有高克隆性扩增（4B），与相邻组织相比，7例患者中有4例肿瘤的扩增克隆增加(图4B)。每个簇实际上是由不同的克隆型组合子集组成的（4C）。CD8 T细胞的克隆细胞明显多于CD4 T细胞，naïve CD4-C1-CCR7细胞的克隆扩展非常有限(图4d)。与相邻组织相比，肿瘤中的treg具有更多的克隆数量(图4f)，这表明特异性克隆细胞的扩张可能是肿瘤中treg比例更高的原因。作者发现CD4细胞中包括Tregs在内的所有簇间的TCR序列共享，而CD8细胞中除C2外的所有簇间的TCR序列共享(图4G-H)。CD8-C7-TIGIT和CD8-C5-CCL5和CD8-C6-STMN1之间共享的克隆数分别为166个(9.0%)和156个(8.4%)(图4I)。Treg型CD4-C6-FOXP3在肿瘤中具有相同的趋势，在CD4-C1-CCR7中显示14.4％的共享克隆型，在相邻组织中显示40.7％(图4j和补充图8c)。细胞毒性细胞、力竭细胞和Treg细胞中的克隆T细胞在肿瘤和邻近组织之间的TCR有限(补充图8d)，这表明一些Treg细胞和naïve CD4 T细胞可能具有共同的起源。作者的数据与最近的一项研究一致，该研究报道不同簇的T细胞并非完全独立，但可能会经历广泛的状态转变。

总结：作者根据单细胞测序的结果发现在癌症细胞中CD4+、CD8+T细胞，NK细胞与临近组织相比有较明显的变化，且在肿瘤环境中存在免疫抑制。 PS. 由于篇幅有限这次的分享分成了上下两部分，预知后事如何，且看下期分解哦~ PSS. 留言可以获得相关文献信息~

本文涉及技术： 流式细胞术

本文涉及技术： 免疫组化