本周为大家带来的文献为2024年4月发表于Cell Stem Cell（IF：23.9）的文献‘Activating innate immune responses repolarizes hPSC-derived CAR macrophages to improve anti-tumor activity’。

CAR-T疗法在血液肿瘤的治疗取得了巨大进步，然而，由于缺乏肿瘤特异性抗原、T细胞贩运和浸润效率低下以及肿瘤微环境（TME）具有免疫抑制作用等问题，这种方法在实体瘤方面的应用受到了限制。巨噬细胞因其不受MHC限制就可以吞噬和杀伤肿瘤细胞、可被招至浸润肿瘤微环境、具有可塑性、可以增强抗肿瘤反应等性质，具有被发展为嵌合抗原受体巨噬细胞（CAR-Ms），作为一种新型肿瘤免疫疗法的潜力。

该研究的重点是提高从人类多能干细胞（hPSCs）中提取的嵌合抗原受体巨噬细胞（CAR-

Ms）的产量和功能，以用于癌症免疫疗法。作者开发了一种基于单层的高效系统，可从hPSCs中生成大量功能性巨噬细胞。他们还优化了CAR-Ms的结构，以提高这些CAR-Ms的稳定性和抗肿瘤活性。 通过激活先天性免疫反应，他们使hPSC-CAR-Ms重新极化，提高了它们的杀瘤活性，并证明这些巨噬细胞还能激活T细胞，从而增强整体抗肿瘤效果。

实验方法

1、从hPSCs生成巨噬细胞：

单层培养系统：研究者使用单层培养系统，将hPSCs分化为巨噬细胞。此系统涉及以下逐步分化步骤：

中胚层形成（第2天）： 使用因子包括Activin A、BMP4、CHIR99021和Y-27632。

造血内皮细胞（HE）规格化（第4天）： 使用VEGF和FGF2。

髓系祖细胞生成（第11天）： 使用SB-431542、SCF、TPO、Flt3L和IL-3。

巨噬细胞分化（第14-23天）： 使用Flt3L、M-CSF和GM-CSF。

2、CAR结构优化：

研究人员筛选了不同的CAR结构，以确定能够在体外提供稳定的CAR表达和强效抗肿瘤活性的最佳结构。将最佳CAR结构整合到hPSCs中，以生成hPSC-CAR-Ms。

3、重新极化和激活先天免疫反应：

重新极化：研究者使用干扰素-γ（IFN-γ）和单磷酰脂质A（MPLA）将hPSC-CAR-Ms重新极化为肿瘤杀伤表型（M1巨噬细胞），远离促进肿瘤的M2表型。

先天免疫激活：激活NF-κB和NOD样受体通路等路径，以增强hPSC-CAR-Ms的先天免疫反应。

4、功能分析和肿瘤杀伤活性：

体外实验：通过进行各种体外实验，以评估hPSC-CAR-Ms的吞噬活性、细胞因子分泌和表面标志物表达。

体内疗效：使用小鼠模型测试hPSC-CAR-Ms的抗肿瘤活性。评估巨噬细胞激活T细胞和增强抗肿瘤免疫反应的能力。

重要发现

在开发了稳健高效的生成功能性hPSC-Ms的单层平台之后，研究者描绘hPSCs分化出巨噬细胞的全面转录图谱，并揭示了hPSC-Ms和PB-Ms的异同点。为了获得与巨噬细胞兼容的 CAR，研究者为CAR的胞内结构域设计了不同的结构，这些结构域针对CD19，从hPSCs中获得了适合巨噬细胞分化的CAR结构，生成的hPSC-CAR-Ms更倾向于表现出促炎症表型。通过LabEx提供的Luminex检测技术，比对CAR-Ms和VEC-Ms两组的细胞因子分泌情况，发现前者自发分泌更多的TNF-a、IL-1b或IL-6（下图K），因此具有更强的促炎作用。

  通过Luminex 测量来自CAR-H1或VEC-H1的巨噬细胞培养上清液中的细胞因子数据代表平均值 ± SEM。*P < 0.05; ***P < 0.001

为了进一步评估hPSC-CAR-Ms的效应以及在体外杀死肿瘤细胞的功能，研究者使用了两个人类伯基特淋巴瘤细胞系和一个 B 型急性淋巴细胞白血病（B-ALL）细胞系作为 CD19+ 靶细胞，一个人类急性T淋巴细胞白血病细胞系（Molt4）作为 CD19 靶细胞，并用 hPSC-VEC-Ms 作为阴性对照。H1-CAR-Ms成功地靶向并且聚集、吞噬了肿瘤细胞。结果表明。

H1-CAR-Ms and BC1-CAR-Ms在和Nalm6或Raji共培养的情况下，都具有释放TNF-a, IL-6, IL-1b, and IL-12p70因子的潜力（下图E）。在其它的血液肿瘤的细胞中，也呈现了相似的结果。这些结果共同表明了hPSC-CAR-Ms可以有效地在体外以抗原依赖的方式杀死肿瘤细胞。

通过Luminex测量与靶肿瘤细胞共培养24小时的 H1-CAR-Ms或H1-VEC-Ms上清液中的细胞因子（TNF-a、IL-6 和 IL-1b）

研究者继续证明通过给体内的hPSC-CAR-Ms施用MPLA+IFN-g可提高其杀瘤功效。通过激活体内先天适应性免疫反应，可以进一步增强 hPSC-CAR-Ms 的抗肿瘤活性。因此本研究最终建立了一种可行的方式，可以有效地提高(hPSC-CAR-Ms)的产量和功能，支持将其转化为临床应用。