本周为大家带来的文献为发表于《Gadd45g insufficiency drives the pathogenesis of myeloproliferative neoplasms》（IF:16.6）。本文使用了LabEx提供Luminex多因子检测服务。

该研究揭示了GADD45g基因在骨髓增生性肿瘤（MPNs）中的作用。研究发现生长停滞和DNA损伤诱导γ（GADD45g）在骨髓增殖性肿瘤患者中的表达水平显著降低，而JAK2V617F突变和组蛋白去乙酰化导致了其表达的降低。GADD45g的下调在人类MPN细胞中起着促进肿瘤生长的作用。小鼠造血系统中Gadd45g的缺乏会导致髓系偏型造血干细胞的生长和自我更新能力显著增强，并出现类似MPN的表型。从机理上讲，GADD45g不足的致病作用是通过RAC2、PAK1和PI3K-AKT信号通路的一连串激活介导的。这些数据表明，GADD45g 缺乏是多发性骨髓瘤的一种新型致病因素。

主要发现

GADD45g在多发性骨髓瘤中下调，其低表达在人类多发性骨髓瘤细胞中具有促瘤活性

在骨髓增生性肿瘤（MPNs）患者中，GADD45g基因表达水平显著降低。这一结果来自对ET和PV患者的CD34+和骨髓单个核细胞（BMMNCs）进行的研究，其mRNA和蛋白水平均有所降低。另外，针对PV和PMF患者的CD34+细胞的独立队列研究结果也证实了GADD45g的显著下调。进一步实验表明，MPNs患者中GADD45g水平与其克隆形成能力呈负相关。通过对MPN细胞株HEL和SET-2进行GADD45g表达的基因敲减和过表达实验，发现GADD45g下调显著促进了细胞的克隆形成能力和增殖，抑制了凋亡，并对细胞周期产生了适度影响。总体而言，这些发现表明，GADD45g在MPNs中的异常下调可能作为肿瘤促进因子起作用。

图1 人类 MPNs 细胞中 GADD45g 的表达减少具有促肿瘤功能

缺乏Gadd45g会导致4-6月龄小鼠的血液参数发生畸变

研究发现，在骨髓增生性疾病患者中，GADD45g的表达水平普遍较低，并且通过cBioPortal分析发现，在各种骨髓恶性肿瘤中，包括AML、MPN和MDS等，GADD45g基因突变率极低。因此，为了探究GADD45g在骨髓恶性肿瘤发病机制中的作用，研究人员通过交配Gadd45gflox/flox小鼠与Vav-Cre小鼠，生成了造血系统特异性的Gadd45g杂合（Gadd45g+/−）和纯合（Gadd45g−/−）敲除小鼠模型。研究发现，Gadd45g缺失小鼠的长期造血干细胞（LT-HSCs）具有显著增强的自我更新能力，并出现了异常的血液学参数，包括血浆、骨髓和脾脏中髓系分化偏向以及脾脏明显增大。进一步的流式细胞术分析显示，Gadd45g缺失小鼠骨髓中偏向于髓系的干细胞数量显著增加，而淋巴系干细胞数量保持不变。这些数据表明，Gadd45g的缺失会导致偏向于髓系的干细胞数量和自我更新能力的增强，以及髓系分化偏向，这些现象在小鼠年龄超过4个月后逐渐显现。

图2 Gadd45g 缺乏会导致4-6个月大的小鼠血液学参数失常，并增强造血干细胞的自我更新能力

Gadd45g缺乏会导致小鼠在 10 个月大后出现骨髓增生性肿瘤

研究发现，GADD45g在骨髓增生性肿瘤（MPN）患者中表达水平较低，且在多种髓系恶性肿瘤中几乎不发生基因突变。为探究其在MPN发病机制中的作用，研究团队利用小鼠模型发现，GADD45g缺陷导致骨髓中My-biased HSCs数量和自我更新能力显著增加，进而引发明显的骨髓增生性肿瘤。进一步的实验表明，重新引入GADD45g可延长小鼠的存活时间并减轻疾病症状，证实了其在MPN发展中的重要性。此外，GADD45g缺陷导致的肿瘤发展与体细胞突变无关，提示了其作为MPN治疗靶点的潜力。

图3 Gadd45g 基因缺失会诱发 10 个月大的小鼠出现多发性骨髓瘤

图4 Gadd45g 缺乏诱导的MPN可移植，重新引入Gadd45g可显著延长MPN小鼠的存活期

Gadd45g缺乏症通过激活PI3K-AKT信号通路诱发骨髓增生性肿瘤

研究发现，MPN患者骨髓单个核细胞中GADD45g的中位数mRNA表达水平约为健康个体的两倍降低，与Gadd45g+/−小鼠的降低水平相似。因此，我们选择了Gadd45g+/−小鼠进行后续实验。通过对携带MPN的Gadd45g+/−小鼠与对照小鼠的c-kit+骨髓细胞进行RNA测序分析，发现PI3K-AKT信号通路在Gadd45g缺陷细胞中的上调基因中排名最高。进一步的基因集富集分析进一步确认了该通路的激活。这些RNA测序结果得到了Western blot验证。与小鼠观察结果一致，HEL和SET-2细胞中GADD45g的敲低导致PI3K和AKT的活性增强。进一步的研究表明，AKT激酶抑制剂MK-2206的治疗可以部分逆转Gadd45g缺陷引起的缩短存活时间，WBC计数增加，脾重量增加以及骨髓中My-biased HSCs数量增加等异常。此外，MK-2206治疗也可以完全逆转HEL和SET-2细胞中GADD45g敲低导致的增强的克隆能力和增殖以及凋亡减少。MK-2206的治疗还大大减少了GADD45g低表达MPN患者CD34+细胞中GADD45g表达低组的克隆优势。这些结果表明，PI3K-AKT信号通路的激活介导了Gadd45g不足在MPN中的肿瘤促进作用。

图5 Gadd45g缺乏会诱导PI3K-AKT通路的激活

图6 抑制 PI3K-AKT 通路可消除Gadd45g缺乏对MPN的肿瘤促进作用

Gadd45g缺乏症通过RAC2-PAK1轴诱导PI3K-AKT通路的激活

研究表明，所有的GADD45家族成员都是小、酸性蛋白质，通常通过与其他调节蛋白相互作用发挥功能。通过对野生型小鼠的c-kit+骨髓细胞进行免疫沉淀（IP）结合质谱（MS）筛选，我们发现了RAC2，这是唯一在造血细胞中表达的促进MPNs进展的蛋白质，作为潜在的相互作用蛋白质。通过共免疫沉淀（co-IP）实验证实了GADD45g与RAC2的直接相互作用，并进一步通过明显的GADD45g与RAC2的共定位加以确认。进一步研究发现，Gadd45g的异源缺失导致与RAC2的相互作用明显减少，并且激活的RAC2-GTP水平显著增加。一致的结果在GADD45g敲低的人类MPN细胞系中得到验证。我们的研究显示，GADD45g与RAC2相互作用并抑制其活性，而Gadd45g不足导致GADD45g-RAC2复合物的解离并释放了对RAC2激活的抑制。

图7 RAC2-PAK1通路介导Gadd45g不足诱导的PI3K-AKT激活

PAK是丝氨酸/苏氨酸激酶，是Rho-GTPases家族的主要下游效应蛋白，其中只有PAK1的活化已被证明与MPNs的发病有关。我们进一步研究了GADD45g敲低是否通过RAC2-PAK1通路介导PI3K-AKT的活化。结果显示，Gadd45g缺失显著增强了PAK1的活性。进一步的研究表明，通过慢病毒shRNA下调RAC2不仅大大减少了PAK1和PI3K-AKT的激活，而且逆转了GADD45g敲低导致的HEL和SET-2细胞克隆形成能力增强和凋亡抑制。PAK1抑制剂IPA-3的给予也在这些细胞中产生了类似的效果。与AKT激酶抑制剂MK-2206类似，RAC抑制剂EHT 1864或PAK1抑制剂IPA-3的治疗显著减少了GADD45g低表达MPN患者CD34+细胞中GADD45g表达高组的克隆优势。这些结果表明，Gadd45g不足诱导MPN涉及了一系列信号事件的级联，包括RAC2、PAK1和PI3K-AKT的连续激活。

图8 抑制 RAC2或PAK1可逆转GADD45g缺乏对人类 MPN细胞的肿瘤促进作用

Gadd45g 缺乏会诱导炎症细胞因子的异常产生

研究表明，慢性炎症在MPNs的发病机制中起着关键作用。为了调查Gadd45g不足是否导致细胞因子产生失调，我们使用Luminex (LabEx提供Luminex多因子检测服务)测定了4个月、6个月以及末期Gadd45g+/−小鼠和其年龄相匹配的对照组中几种已被报道在MPNs中具有重要意义的炎症因子的血清浓度。结果显示，在MPN发病后，IL-4、IL-6、CCL3和GM-CSF的水平在Gadd45g+/−小鼠中显著增加，与患者的临床观察结果一致。

此外，为了检验GADD45g的水平是否与细胞因子产生呈负相关，我们同时测量了参与我们GADD45g表达分析的一些MPNs患者的血清细胞因子水平。我们将这些患者分为GADD45ghigh和GADD45glow表达者，并观察到IL-4和IL-6水平在GADD45glow MPNs患者中显著高于其相应的GADD45ghigh对照组。

图9 Gadd45g 缺乏导致炎症细胞因子分泌异常

JAK2V617F突变和组蛋白去乙酰化参与了多发性骨髓瘤中GADD45g的沉默，GADD45g的下调部分介导了多发性骨髓瘤异种移植模型中JAK2V617F的活性

这项研究揭示了几个重要发现。首先，研究发现JAK2V617F突变可导致GADD45g表达下调，而GADD45g减少部分介导了JAK2V617F在MPN中的致病作用。通过体内实验，研究人员发现使用JAK2抑制剂ruxolitinib可显著降低肿瘤负荷，并显著提高BMMNCs中GADD45g的表达水平。此外，在小鼠模型中，GADD45g的下调部分介导了JAK2V617F的致病性。这一发现为MPN的治疗提供了新的靶点，并揭示了GADD45g在疾病发展中的重要作用。

其次，研究发现组蛋白去乙酰化与GADD45g在MPN中的降低表达相关。通过使用选择性HDAC1/2抑制剂Romidepsin，研究人员观察到GADD45g的显著上调，提示组蛋白去乙酰化可能是调控GADD45g表达的重要机制之一。这一发现为治疗MPN提供了新的方向，并为深入理解MPN的病理机制提供了线索。

图10 JAK2V617F突变和组蛋白去乙酰化抑制了GADD45g 的表达，而 GADD45g 的减少在JAK2V617F MPN中起到了促瘤作用。