Single-Cell Transcriptome Profling Reveals Multicellular Ecosystem of Nucleus Pulposus during Degeneration Progression

生活中发生腰痛很常见。随着现代生活压力增加，很多人不注意腰部保健。腰部损伤可以使椎间盘老化退变或小关节 结构紊乱、椎间隙变窄等，其中核(NP)退变是导致椎间盘退行性变(VDD)和腰痛的主要原因，但潜在的分子机制和 细胞异质性尚不清楚。

苏州大学第一附属医院邹俊老师研究团队(澳大利亚新南威尔士大学涂计博士，李文甜博士，澳大利亚昆士兰大学杨思东博士，共同第一作者)发表在Advanced Science(IF=16802)上的文章，题目为Single-CellTranscriptome Profling Reveal Muticellular Ecosystem of Nuceus Pulposus during Degeneration Proqression。这篇文章利用单细胞测序等技术，揭示了髓核在 椎间盘退行性变中的发生进程。

BD Rhapsody单细胞多组学测序系统

单细胞转录组测序，实时荧光定量技术，免疫组化技术，免疫荧光技术，流式细胞分选术，细胞培养技术等。

首先，作者利用单细胞测序技术，从八名不同级别的IVDD患者中分别分离出NP组织，总共获得39732个细胞。研究者 利用mrkergene判定分析，鉴定出6个主要的细胞亚型，分别为肥大软骨细胞样NPCs(HT-CLNPs)，效应NPCs(effector NPCs稳态NPCs( homeostatic NPCs )，监督NPCs（regulatory NPCs),纤维NPCs (fibroNPCs)，粘附 NPCs ( adhesion NPCs)。 另外，级VDD患者中主要是HT-CLNPs和regulatory NPCs，亚和IV级要是HT-CLNPS和effectorNPCs，V级主要是broNPC 和adhesion NPCs。最后作者利用实时荧光技术和免疫组化技术进行了验证，结果与单细胞分析数据一致。

接下来作者分析了不同级别IVDD惠者的转录本信息，鉴定出了一系列与退行性程度相关的转录因子(LMX1A，PRDM1 REL等)。随后，作者利用差异表达基因分析，GO Pathway富集分析，发现了与IVDD发展级别关的基因(HSPH1、CTGF MMP13、HSP90AA1)在重度IVDD患者中热休克蛋白基因(HSPA1B、HSPH1HSP90AA1等)显著上调，说明了stress-related 机制在IVDD中的重要性。此外，作者还发现了一系列可能会引起退行性发生的通路，包括抗原加工和呈递通路、TNF通路、 MAPK通路及Hippo通路等。

基于已有研究:神经支配，血管生成和细胞衰老与IVDD的发生相关。为了分析亚群之间的功能差异，作者利用GO富集 分析，发现在血管生成方面，braNPCs占比最高。而后作者利用QuSAGE分析、SCENIC分析，发现regulatory NPCs中高表达的 基因(CXCL3、IL-6和CHI3L1)参与了细胞炎症和内源性刺激的反应，表该细胞亚型可能具有调节免疫的功能;homeostati NPCs中与细胞内平衡相关(翻译调控和蛋白质/RNA代谢)的基因高表达;adhesion NPCs具有细胞迁移和细胞基质黏附作用， HT.CLPs中与细胞周期阻滞和衰老相关的基因表达活跃，且鉴定了HT-CLNP·工和HT-CLNP五，作者又利用拟时序分析揭示了 HTCLNP-I和HTCLNP-工的演化进程。

接下来，作者研究了不同细胞亚群之间的关系并利用细胞轨迹重建分析揭示了细胞分化方向和细胞谱系轨迹。细胞间 的分化顺序为fbroNPCs、adhesion NPCs、efector NPCsregulatory NPCs、HT-CLNP和homeostatic NPCs。另外，研究者利用 scVelo轨迹分析发现，fbroNPs具有分化成其他亚型细胞的潜力，是主要的终未期髓核细胞，表明broNPCs具有干细胞特性。 进一步，基于细胞亚群划分和基因表达情况，作者发现CD90在broNPs中特异性表达，推测CD90NPCS是fbroNPCs的主要 干细胞群体。最后，作者利用实时荧光技术，细胞培养技术，染色技术，免疫英光技术等验证了fbroNPCs可促使NP退变。

在NP中除了有髓核细胞外，还有免疫细胞，作者共鉴定出了9种类型免疫细胞，包括单核细胞和巨噬细胞( marker为 CD163),中性粒细胞(marker为FCGR3B (CD16b)和 HLADR) GMPS细胞(marker为MS4A3MPOELANE)，NK细胞 (marker为CD94)，粒细胞性髓系源性抑制细胞(G-MDSCs marker为ITGAM(CD11b), OLR1，ARG1)等。而后作者利用拟 时序分析，预测了免疫细胞的分化方向是从GMPs，G-MDSS到中性粒细胞。进一步，作者通过流式分选技术分离出 CD45+CD1b+OLR1+ CD24+/-的G-MDSCs，发现轻度退行性NP组织中的G-MDSCS约是重度的3倍。在大鼠模型中利用免疫 组化和免疫荧光进行验证，也发现G-MDSCs在重度模型中的减少。

基于上述研究结论，作者推测G-MDSCs细胞在IVDD病程发展中至关重要。随后，作者通过流式分选技术分离出 CD45+CD11b+OLR1+CD24+/-的两群G-MDSCs，利用免疫抑制实验和活性氧(ROS)检测技术及细胞共培养等技术，对 G-MDSCs的进行功能验证，结果发现G-MDSCS具有免疫抑制细胞和ROS产生的能力，其中CD24+的免疫抑制能力和ROS产 生更强。另外有研究表明白细胞介素( L-1B)可诱导髓核NP退行性发生。作者将G-MDSCS与NPCs共培养(加入L-1B)，发 现聚集蛋白聚糖(髓核中主要的蛋白多糖)有所增加，而与退行性进程相关的基因(MMP13)表达下降，这表明G-MDSCS可 缓解IL-1B介导的NPCs的退变。

最后，作者利用细胞通讯分析探究了细胞间的相互作用，结果发现巨噬细胞与其他类型细胞的相互作用最多，而NPCS 间的相互作用最为活跃。对免疫细胞与退行性NPCs间的通讯网络预测发现，NPCS上的受体(FN1，FGF 与免疫调节相关的 细胞因子(TNF;IL-6,PDGF,TGFB等)存在相互作用。以上结果表明免疫细胞和NPCS在NP中的发挥着重要的调节作用，例如 炎症平衡，细胞增殖和血管生成等。

本研究中作者利用单细胞测序等技术，共鉴定了NPCs的6种细胞亚型，在分析各个亚型的潜在功能时，作者发现 fbroNPCs( marker gene:CD90)是退行性P组织中的干细胞，另外粒细胞G-MDSCs具有缓解椎间盘退行性发展的潜能。总 之，该研究中揭示了NP的多种NPCs亚型的特征，为IVDD治疗提供了新思路。