Discovery and Application of Postnatal Nucleus Pulposus Progenitors Essential for Intervertebral Disc Homeostasis and Degeneration

椎间盘稳态在很大程度上依赖于髓核细胞(NP)的功能与状态，但因椎间盘高渗透压、营养缺乏和缺氧的微环境，针 对椎间盘退变(IDD)的多种外源性的干细胞疗法受到很大挑战，寻求自身来源的干/前体细胞可能是治疗IDD的新思路。

针对IDD治疗和干细胞发掘问题，国际学术期Advanced Science(IF=16.802)在线发表了标题为Discoveryand Applica stasisand Degeneration”。中科院分子细胞科 tion of Postnatal Nuceus Pulposus Proaenitors 学卓越创新中心邹卫国研究员和空军军医大学西京医院骨科罗卓荆主任为该论文的共同通讯作者，西京医院骨科高博副教 该研究首次鉴定出小鼠髓核细胞存在相细胞亚群，扩充了椎间盘稳态 授和分子细胞中心蒋博博士研究生为共同第一作者 维持及退行性变的细胞学机理，为椎间盘退变及损伤修复提供了新的诊断和治疗靶点。

BDRhapsody参与本研究中的单细胞测序工作，下面我们一起了解一下本文的研究思路和数据分析过程吧 ~

BDRhapsody单细胞分析系统

Shh-Cre;R26R^tdTomato 小鼠的髓核

小鼠模型构建，谱系示踪法，单细胞测序技术，实时荧光定量技术，免疫荧光技术，流式细胞荧光分选术(FACS)等。

细胞类型鉴定，差异基因表达分析，G/Pathway分析，拟时序分析，SCENIC分析，QUSAGE分析，细胞通讯分析等。

鉴于NP在椎间盘中的特殊解剖位置，使其在不受附近其他细胞污染的情况下单独分离非常困难。为此研究团队引进了 Shh-Cre:R26RtoTom小鼠模型(Shh可特异性标记NP细胞)，结合流式分选技术共获得了4910个核细胞并进行单细胞测 序，无监督聚类分析鉴定出了4类髓核细胞亚群并用t-SNE进行可视化展示，包括ProNPs(约占7.5%)，RegNPs(约占 42.7%)，HomNPs(约占34.5%)和一个过渡态的中间群(TransNPs,约占15.3%)。

为探究4种NP细胞的潜在功能性，研究者进一步对其进行了全面的生物信息数据分析:MarkerGene鉴定分析发现 RegNPs特异性高表达Unc5c和BMP7等基因(与轴突引导、血管生成、软骨发育等多种功能相关)，由于NP是一种无 管、无神经支配和免疫沉默组织，该些基因的高度富集表明RegNPs可能是椎间盘退变的“罪魁祸首”，而免疫荧光染色也证 实了BMP7+ RegNPs亚群的存在。此外，G0分析和QUSAGE分析发现该种细胞参与细胞周期，细胞因子产生和代谢/生物合成 过程、TCA循环和脂肪酸代谢等重要的代谢过程。

利用Markergene鉴定分析和GO分析发现，HomNP细胞中高度富集Gdf5、Agt和Mmp3等基因，主要参与并影响了缺 氧反应、胶原蛋白分解代谢、血管生成以及纤维化等过程，这是IDD典型的症状表现。此外，小鼠椎间盘和不同退变程度 的(患者)样本的免疫荧光染色也证实了Gdf5+HomNP的特异性表达。

针对自身来源的干/前体细胞缺乏标记物(特别是膜蛋白)和髓核前体/祖细胞的演化与功能尚不明确的问题，作者对NP细 胞亚群进行了拟时序和细胞速率分析，发现ProNPs是分化的起点，其表达大量的“干性”基因(LepR/ Thy1等)参与细胞的生 长和分化调节。此外ProNPs特异性表达基因Uts2r，而免疫荧光染色也证实UTS2R的特异性表达，可作为一种新的ProNP 的细胞表面标记物。

接着，作者构建了Uts2r-CreERT2;Rosa26工程小鼠，对UTS2R+PrONPS细胞类群进行了深入研究，通过谱系示踪发 现，UTS2R标记的PrNPs随小鼠年龄的增长数目增加，且能够增殖并分化成BMP7+ RegNP及GDF5+ RegNPs，以上发现证实了 成体期髓核前体/祖细胞的存在。

通过流式细胞分析发现，UTS2R+ProNPs高表达间充质干细胞等相关标志基因，如CD44,CD90,CD73，CD105等，并 且经流式分选后体外培养的UTS2R+ ProNPs具有向成骨、成软骨和成脂进行三系分化的能力，进一步证明了UTS2R+ ProNP 作为髓核祖细胞具有增殖和分化能力。在小鼠椎间盘退变模型和IDD临床组织样本中发现，随着椎间盘退变严重程度的增 加，UTS2R+ProNPs的数目逐渐减少并趋向耗竭。

基于已有的研究:外源干细胞的移植可以在一定程度上减轻IDD的进程并促进细胞间基质(ECM)重构。作者建立了 针刺损伤的IDD模型，并在损伤后移植UTS2R+ PrONPs，通过X-ray分析椎间盘高度和Safranin 0/Fast Green染色分析，发现 UTS2R+ ProNPs能够有效缓解IDD进程。

为探究UTS2R+ProNPs缓解IDD进程的潜在微环境，作者发现了一种特异性分泌的基质蛋白Tenascin-C(TNC，一种ECM 糖蛋白，具有维持干细胞的微环境并调节其增殖作用)，该蛋白可参与维持ProNPs的黏附及活性。而将UTS2R+ProNPs和 Tenascin-C共同移植到针刺损伤的IDD小鼠模型的方法，可最大程度的缓解IDD的进程。

该研究利用单细胞转录组测序技术定义了4个主要的不同功能性髓核细胞亚群，并通过谱系示踪的方法首次鉴定出小 鼠成体期髓核细胞存在和田胞亚群(UTS2R+ProNPs)，其高表达间充质干细胞相关标志物，具有克隆形成及三系分化的能 力。此外，特异性分泌的细胞外基质蛋白Tenacsin-C能构成UTS2R+ProNPs自身潜在的细胞外微环境，参与维持ProNPs的黏附 及活性，对延缓椎间盘退变方面可能起到重要作用。