The tumour microenvironment shapes innate lymphoid cells in patients with hepatocellular carcinoma

肝癌的一个诱发因素是肝脏慢性炎症，它主要是由于感染HBV/HCV病毒或者酒精性和非酒精性脂肪肝引起的。细胞因 子在肝脏炎症和肝癌发展过程中的调节免疫过程起着重要作用。ILCs参与形成细胞因子环境并受细胞因子调节，调节炎 症、黏膜防御和许多疾病过程的组织修复。

发表在Gut (IF=23.059 )上的文章“The tumour microenvironment shapes innate lymphoid cells in patients with hepatocellularcarcinoma”，揭示肝癌肿瘤微环境塑造固有淋巴细胞(Innate lymphoid cells，ILCs)相关机制。本文结 合流式技术、传统bulk RNA测序技术和单细胞多组学技术，揭示了肝癌患者通过细胞因子调控ILCs组成来影响肝癌进展的 相关机制。

01   细胞因子在肝癌肿瘤微环境中的表达与生存率有关

作者通过对来自肝癌患者肿瘤(T)、癌旁(M)和非肿瘤组织(NT)的样本进行了Buk Tissue RNA测序，聚类分析显 示肿瘤与非肿瘤组织之间的基因表达差异巨大(图1A)。其中有三种细胞因子(L-1B、L-33和TGB)已被描述影响C 的可塑性和功能。该三个细胞因子在肝癌、癌旁以及非癌组织中也呈现差异表达(图1CE)。其中IL-33的高表达，能显著 改善TCGA队列中的总体存活率(图1F)。

为进一步分析细胞因子的蛋白水平变化，作者通过流式技术检测发现，相同患者的肿瘤和非肿瘤织的上清中，14种 细胞因子浓度存在差异(图1B)。存活率分析显示，高表达TGFB2、IL6、IL8、L10和低表达IL1B、IL23A、IL17A、 CD40LG、IL2、IL15、L12A、L9、IL33L4的患者均表现出较差的存活率，说明肝癌存在特征性的上调和下调的细胞因 子，进而诱导出免疫抑制微环境。

02   ILCs在肝癌患者肝肿瘤癌旁和非肿瘤肝组织中的分布

为分析肝癌中ILCS各亚群的比例、分型以及分布模式，作者通过流式技术分析了48例肝癌患者的非肿瘤、癌旁、肿瘤 以及外周血的单个核细胞。用系别Marker染色来鉴定Lin+细胞。其余Lin-细胞用LCS表面标记CD127、CD117(ckit) CD294(CRTH2)、CD336(NKp44)进行染色(图2A)。结果显示CD127+ILCs在肝癌非肿瘤、癌旁、肿瘤组织中的分布 存在差异。具体表现为从非肿瘤到肿瘤组织中的ILC1s和ILC2S占比增加，而LC3s占比降低(图2C，E)。尽管ILC2S百分含量 随着肿瘤的增加而增加，但只有少数患者IL2/LC1比值>1，作者将其标记为ILC2/ILC1高组患者(图2F)。

通过tSNE分析，作者在肝脏Lin-细胞中鉴定了CD127·细胞亚群(图2A)。Lin-CD127-细胞具有NK细胞和ILC1s的共同特 征，被命名为NKike细胞(图2C)。并进一步检测了这群细胞中Eomes、Tbet、CD56、cKt等分子的表达情况(图2B)。

为了更好地了解肝癌中ILCs组成的异质性，作者利用单细胞多组学技术，将靶向转录组扩增数据(405个转录本)与膜 蛋白检测相结合，深度解析了肝癌ILCS各亚群的转录本及蛋白表达特征。

01   肝癌肝脏中ILCs的转录特征

首先作者发现，SCRNA:seq分析ILCs分布与流式结果相匹配(图3A-C)。其中4例患者(患者6、19、20和21)从非肿瘤 到肿瘤组织的ILC2s百分含量增加，属于ILC2/ILC1比值高的组。2例患者(患者10和17)LC2/LC1比值较低( 图3A-C)。

其次，通过单细胞聚类和t-SNE分析确定了主要的ILCS分群(图3D)。ILCs主要亚群的鉴定是通过特征Marker的转录本 或膜蛋白Abseq(图3E)并进一步将ILCs注释为4大胞亚群(ILC1sILC2、ILC3s和NK-ike)及12个分亚群(图3F)。

相比于肿瘤组织，非肿瘤NK-like细胞富集ILC3s转录本，其特征与之前报告过的NK-ike progenitor相似(图3M)。

最后，ILCs在非肿瘤、癌旁及肿瘤组织中的占比与流式结果相似，LC2s和NK-ke亚群主要来源于肿瘤组织，带有更多 NKMarker的NK-ike细胞则主要存在于非肿瘤组织。ILC3s作为ILC主导亚群存在于所有区域(图3N)。

02   ILC2/ILC1比值不同的患者存在转录特征差异

作者分别分析了ILC2/MLC1比值高或低这两组患者的Ls(图2E)。对ILC2/LC1高比值患者的IL7R+ILCs进行聚类，发现 了13个ILCs亚群(图4A)，并进行了注释(图4B)。

对肿瘤组织和非肿瘤组织的ILCs比较，发现ILC1s高表达辅助ILC1 Marker(图4C)，肿瘤中的LC2s呈激活表型，高表 达因子见图4D，LC3s在非肿瘤组织中显示了高促进血管生成的VEGFA(图4E)。

同理，作者对ILC2/MLC1低比值组的聚类分析显示11个细胞亚群，并进行了注释。非肿瘤组织中，ILC1s处于NKike细 胞和辅助1LC1s之间的中间阶段。与LC2/1LC1高组相比，ILC2s和ILC3s在肿瘤中特异性上调的基因较少，在非肿瘤性肝中， ILC3s表达促血管生成的的VEGFA和促纤维化的IL32。

03   肝癌介导的ILCs可塑性可由细胞因子诱导

接下来，作者对Lin-细胞进行了轨迹分析，以确定ILCs亚群和中间群体之间的关系。

轨迹分析显示NKlke细胞向CD6+/-辅助ILC1s过渡，并最终分化为ILC2s、ILC3s(分支2)和CD6LC1sILC3s(分支3) (图5A)。ILC3s在分支2和分支3之间分离，表明它们有过渡到ILC2s和ILC1s两种亚群的潜力(图5B)。

非肿瘤组织的细胞轨迹分析证实了NK-ike细胞亚群的异质性，并开始从NK-ike细胞到CD6+ILC1s的可塑性(图5C)。癌 旁组织样本的NKike细胞表现出更多的多样性，有多个分支(图5D)。在肿瘤ILCS中，作者发现ILC1s和ILC3s贡献ILC2S作 为分化的潜在终点(图5E)。

接下来，作者分别研究LC2/ILC1高和LC2/ILC1低患者ILCs的细胞轨迹。揭示两组间特定的差异。ILC2ILC1高病人在 IL7R+ILCs表现更高的转录变化和可塑性，而ILC2/LC1低病人表现出了NKike细胞多样性(图5F和G)。

体外实验验证了ILCs的可塑性(图5L)。非肿瘤组织上清诱导后，ILC1s增加，ILC3s减少。而肿瘤组织上清诱导后 c-Kit+ILC2s增加，ILC3s和ILC1s的百分含量降低(图5L和M)。

04   ILC相关的细胞因子和成熟的ILC2s特征与更好的生存率相关

ILC2/ILC1比值高的和ILC2/1LC1比值低的患者的差异表明，只有ILC2/ILC1高比值患者对成熟肿瘤ILC2s具有完全可塑 性。通过比较LC2/1LC1高比值和低比值的两组肿瘤，发现ILC2LC1高比值患者的肿瘤中相对高表达，包括IL-33在内的一系 列细胞因子、细胞因子受体和生长因子(图6A)。这些基因的高表达与更好的无进展生存期相关(图6B)。