Single-cell RNA-seq analysis reveals BHLHE40-driven pro-tumour neutrophils with hyperactivated glycolysis in pancreatic tumour microenvironment

一直以来，BDRhapsody因为其温和的细胞捕获原理，而对脆弱细胞有着非常杰出的捕获能力，随着优秀科研成果的 不断发表，这一能力也越来越受到众多科研专家和老师们的认可。

这不最近又新鲜出炉一篇高分佳作-一由瑞金医院陈赛娟教授和沈柏用教授在《Gut》(F=23.06)最新发表，对中性 粒细胞在PDAC中的异质性和促肿瘤机制进行了深入探索与解析。

且值得一提的是，文中对BD Rhapsody平台的中性粒细胞捕获能力给予了明确的肯定，借此也希望给到其他进行粒细胞 相关研究的老师更多参考。

以上内容翻译如下:

人中性粒细胞在体内半衰期短(8小时)，在体外极其脆弱。因此在单细胞实验中,中性粒细胞很难被捕捉并破译其在肿瘤 微环境中的作用机制。值得注意的是在之前使用10x Genomlcs Chromium平台对人类PDAC进行的大多数单细胞研究中没 有检测到中性粒细胞,尽管只有一个例外即Steele等人成功地从PDAC组织中分析出表达典型标记基因的粒细胞。不同的是,使用BDRhapsody平台，我们成功地获得了21972个中性粒细胞的表达谱。同样,在一项前列腺癌的研究中使用BDRhapsody平台在样本中检测到了粒细胞，而使用10xgenomics台的样本中则没有检测到粒细胞。因此直接比较这两种单细胞测序平 台捕获中性粒细胞的能力是有意义的。

胰腺癌是公认的最致命的恶性肿瘤之一，其5年生存率仅为9%，是名副其实的"癌王”。由于胰腺癌的高基质密度对T细 胞漫润产生了物理屏障，因此现阶段的免疫检查点抑制剂和化学抗原体细胞受体疗效甚微。因此，针对先天免疫系统的治 疗干预可能为目前PDAC免疫疗法的替代方案。

该研究提供了胰腺导管腺癌(PDAC)肿瘤微环境中性粒细胞的综合图谱。发现了驱动中性粒细胞朝向促肿瘤亚型的分 子机制，该研究成果将有助于开发针对PDAC患者的新型免疫疗法，为“策反”中性粒细胞提供新的思路。

5名PDAC患者的外周血和PDAC组织、2名健康人(HC)的外周血、2名胰腺炎患者(CP)外周血样本，分离血液 CD66b+中性粒细胞(PMN)和胰腺癌组织CD45+免疫细胞。

BDRhapsody^TM单细胞分析系统

基于前期队列研究发现，TANs在PDAC中大量浸润，且与PDAC患者预后不良相关。利用单细胞测序，研究者共检测到 33891个外周血中性粒细胞和17932个胰腺癌免疫细胞的转录组，进一步划分8种细胞类型，其中中性粒细胞存在两个细胞 群体:Neutrophils1存在于外周血样本，Neutrophils2仅存在于肿瘤组织中。CellphoneDB分析发现，相较于其他的免疫细 胞，巨噬细胞与TANs间存在大量的配受体关系对，如CCL13-CCR1,CCL3-CCR1等，表明肿瘤微环境中两种细胞间的紧密相 作用，这也与免疫荧光染色中TANs和巨噬细胞间的物理距离接近的结果相互印证。

为了进一步研究中性粒细胞的异质性，烈冰为研究者提供了subCluster分析，对PDAC患者的中性粒细胞细分，获得了6 个PMN亚群和6个TAN亚群，PMNS表现出相似的表达特征，而TANs存在异质性:TAN-1亚群高表达血管生成因子VEGFA、促转 移因子PLAU、LGALS3等表现为促的特征:TAN-2与炎症相关(表达NLRP3CD69和IL1RN等基因);TAN-3的基因表达 特征和PMNs类似且高表达与中性粒细胞跨内皮迁移相关的基因(VNN2和SELL)说明TAN-3可能是迁移到肿瘤微环境中的过 渡态细胞，而TAN-4特征性地高表达干扰素刺激基因。

鉴于TAN-3的过渡态特征，研究者应用monocle2算法进一步构建了中性粒细胞状态轨迹的伪时间图，以PMN为分化的 起点，逐渐转化为TAN-3过渡态，随后经过TAN-0和TAN-4的状态，最后达到终末分化状态TAN-2和TAN-1。研究者找到了 1757个随拟时轴显著变化的基因并可归类为3种表达模式，其中第3组基因在肿瘤微环境晚期被激活，并在缺氧、糖酵解、 内质网(ER)应激、IL-1和TNF信号通路等过程富集。进一步，研究者利用ER应激诱导剂(毒胡萝下素(THG))、促炎细胞因子 IL-1B和TNFa以及缺氧的方式，体外刺激了中性粒细胞样分化的HL-60(HL-60)细胞，发现内质网应激和缺氧是诱导中性粒细 胞向TAN-1表型分化的关键因子。

此外，免疫荧光和免疫组化染色证实在PDAC微环境中存在上述4个亚群。有趣的是，VEGFA+TANs(TAN-1)通常位于癌 细胞附近，使其能够发挥促肿瘤功能，结合多个临床数据的进一步分析显示，VEGFA+TANs和PDAC患者的不良预后显著相关。

考虑到代谢状态与免疫细胞的表型、功能息息相关，研究人员进一步分析中性粒细胞的代谢特征，并发现与其他中性粒 细胞亚群相比，糖酵解和缺氧在TAN-1亚群中显著上调，流式细胞分选的LGALS3+TAN(TAN-1)细胞中，葡萄糖转运蛋白 GLUT1和糖酵解酶HK2、PFKFB3和LDHA的表达上调。为了进一步探索TANS代谢特征的空间分布规律，结合空间转录组测序技术 研究者发现相比于间质区，肿瘤和癌旁区域的中性粒细胞糖酵解活性显著上调，此外转录组测序、蛋白组和代谢组的多重分析 均证实了相较于外周血PMN，TAN中糖酵解途径的显著富集。

那么糖酵解途径和TANS的促肿瘤功能有什么关联呢?基于LDHA是糖酵解途径的关键酶，也是TAN-1的关键标志基因，团 队通过体外实验分析了过表达LDHA的dHL-60细胞的功能特征，结果显示过表达LDHA可使dHL60细胞促进肿瘤细胞生长、抑制T 细胞免疫应答。

进一步，研究团队通过SCENIC软件分析驱动TANS异质性的上游转录因子，发现转录因子BHLHE40在TAN-1中显著表达，调控 VEGFA、LGALS3、LDHA和BHLHE40等基因，促进中性粒细胞在肿瘤微环境中向促肿瘤的TAN-1表型分化。BHLHE40过表达和敲除 后，受其调节的上述基因的表达量也呈现相应的上调或下调，说明BHLHE40是中性粒细胞向TAN-1表型极化的关键调节因子，染 色质免疫沉淀实验也证实了BHLHE40对促肿瘤基因的直接转录调节作用。

此外，过表达BHLHE40的dHL-60细胞和PDAC癌细胞共培养后，癌细胞的增殖和迁移能力显著增强。免疫学实验显示 BHLHE40过表达抑制了CD8+T细胞产生促炎细胞因子及淋巴细胞的增殖能力，BHLHE40+中性粒细胞的高浸润也与PDAC不良 预后相关，说明BHLHE40是驱动中性粒细胞向促肿瘤和免疫抑制亚型分化的关键调控因子。

总的来说，研究者利用单细胞测序、空间转录组测序、免疫荧光、免疫组化、代谢组、蛋白组、转录组分析等多种技 术手段，揭示了胰腺导管腺癌中中性粒细胞的作用。鉴定出了一个中性粒细胞的促肿瘤亚群-TAN-1，揭示了TAN中高糖酵解 活性与促肿瘤功能之间的关联，并证明了缺氧和ER应激诱导的BHLHE40激活可驱动TAN促肿瘤表型。