本次小备带来MSD相关最新Poster，内容基于公布于AAPS PharmSci 360 meeting的“Performance of a Digoxigenin Antibody-Based Electrochemiluminescent Hybridization Assay: A HELISA Alternative for Low Femtomolar Detection of an Antisense Oligonucleotide”(基于Digoxigenin抗体的电化学发光杂交测定的性能：反义寡核苷酸低fM的一种HELISA 替代方法)。

PURPOSE

随着反义寡核苷酸（ASO）疗法的迅速发展，对具有灵敏度、特异性和可重复性的寡核苷酸检测方法的需求也在不断增加。杂交酶联免疫吸附试验（HELISA）方法是开发药代动力学（PK）试验的热门选择，用于检测这些ASO药物。这些检测方法通常使用与链霉亲和素涂层微孔板表面结合的生物素化捕获探针和用Digoxigenin（DIG）标记的检测探针。然后用直接标记信号分子的抗 DIG 抗体或在处理底物过程中产生信号的酶来测量分析物。使用SULFO-TAG 标记的抗DIG抗体进行基于电化学发光（ECL）的检测是一种很有吸引力的替代方法，可提高检测灵敏度并改善重现性，多个研究小组已证明它是检测ASO的最有效方法之一。

OBJECTIVES

在此，我们介绍三种ECL杂交检测方案，与标准方法相比，它们进一步提高了检测灵敏度。这些方法无需提取，并使用了新优化的孔板和缓冲液系统。我们还开发了一套系统来提高这些方案的灵敏度。

METHODS

Meso Scale Discovery 电化学发光技术

- 最小的非特异性背景和对分析物的强烈反应产生高信噪比。

- 刺激机制（依赖电）与响应（光信号）脱钩，最大程度地减少了基质干扰。

- 只有结合在电极表面附近的标签才会被激发，因此可以进行在不清洗的条件下检测。

- 标签稳定、无放射性，可直接与生物分子共轭。

- 在~620nm波长处发射可消除颜色淬灭问题。

多轮标签激发和发射可提高光量并提高灵敏度。

为支持短寡核苷酸分析物PK检测的开发，我们开发了一种新的孔板格式。

检测方法设计

根据特定分析物的特征（序列、熔化温度、寡核苷酸修饰等）和代谢物检测的需要，可以选择理想的检测格式，设计探针序列，调整检测条件，以获得最佳性能和便利性。

本研究采用双探针杂交、改良的RNase保护检测和T4 DNA连接酶连接等方法，开发了基于ECL的20bp未修饰DNA分析物（序列：GGCTAAATCGCTCCACCAAG）检测方法。为了尽量减少生物基质中游离生物素的干扰，每种检测方法都设计了捕获探针预包被步骤。对三种检测方法的样品预处理、杂交条件、探针设计和浓度以及孵育时间都进行了改进。

RESULTS

在兔血浆中观察到的基质效应最小

在对稀释液（杜氏改良磷酸盐缓冲液，不含钙和镁；DPBS）中的检测条件进行优化后，在兔血浆中测试了三种检测方法的灵敏度。所有检测方法都显示出极佳的灵敏度，估计检测下限（eLLOD）约为 50 fM，希尔斜率在 0.99 和 1.03 之间。

T4连接测定具有出色的3`分辨能力

杂交测定和RNase保护测定对兔血浆中的3`端修饰显示出较低的特异性，而T4连接测定则能准确区分目标分析物、缩短了一个或两个碱基的代谢物以及3`腺嘌呤类似物。经过一些修改，该连接测定也可用于高灵敏度检测寡核苷酸分析物的5`磷酸化。

N-PLEX ULTRA可提高三种检测格式的灵敏度

N-PLEX ULTRA™信号放大方法可便利地与本文介绍的所有检测方法结合使用。 该方法需要两个额外的孵育步骤，增加了 90 分钟的检测时间。在我们的模型系统使用兔血浆进行测试中，N-PLEX ULTRA 附加元件使检测灵敏度提高了10到50倍，预估的LLOD 值降至低飞摩尔范围。为了进一步降低检测背景，可以对方案进行其他策略调整，从而提高信噪比和检测灵敏度。

CONCLUSION

ECL杂交检测方法为ASO PK检测开发提供了简单、高灵敏度、免提取和高通量的工作流程。杂交和基于酶促反应的方法具有多功能性，可以开发定制的检测方法，用于检测许多短寡核苷酸药物，包括DNA、RNA或siRNA分子。此外，多种检测方法还可用于检测含有化学修饰碱基的寡核苷酸药物。最后，N-PLEX ULTRA系统提高了灵敏度，为超灵敏寡核苷酸 PK 检测开发树立了新标准。