样本前处理

1、动物组织样本

快速从活体中获取目的组织后，快速用RNase-free水清洗去除血渍和污物，吸干表面液体，并快速将样品分割成50-100 mg左右（约绿豆-黄豆大小）的小块液氮速冻后，放入RNase-free的带螺纹旋盖的管中（不建议将样品直接保存于密封袋或者不带螺纹旋盖的EP管中，因密封袋经过液氮速冻后，变脆易破裂，容易导致样品交叉污染；不带螺纹旋盖的EP管容易渗入液氮，导致管内体积膨胀爆管），-80℃低温保存，用干冰运输。

2、植物组织样本

取材新鲜组织，剪切成小块，立即用准备好的铝箔包裹组织，并在铝板上标记样本名称，在液氮中速冻之后转移至-80℃冰箱冻存或长期放置于液氮中。

3、贴壁细胞

首先去除细胞培养上液，然后用1XPBS漂洗1~2次，彻底去除PBS溶液；用足量的TRIzol对细胞进行裂解（一般10cm2的培养皿均匀铺满细胞需要1mlTRIzol），裂解过程中用移液器轻轻反复吹吸，如发现裂解液有明显粘丝现象，表示裂解不是很充分，可以适当增加裂解液的用量，最终是裂解液澄清，没有细胞碎片团块。然后将细胞裂解液转移到1.5ml的EP管中，室温静置继续裂解5min。然后转移至-80℃冰箱长期保存。参考用量为每1×10^6个细胞加1 mL TRIzol。

4、悬浮细胞

先离心收集细胞，然后用1xPBS漂洗1~2次，彻底去除PBS溶液；注意细胞离心收集速度要适度，不要使细胞离心过实而造成裂解液不能充分渗透。再用充足量TRIzol对细胞进行裂解（方法同2.3.1贴壁细胞处理）。裂解在TRIzol中的样品，短期保存于-20℃冰箱中（1周内），如长期保存可转移至-80℃冰箱；参考用量为每1×10^6个细胞加1 mL TRIzol。

5、血液样本

用于提取Total RNA的血液，强烈建议使用血液保护剂送样或分离白细胞后处理送样。常规的EDTA抗凝管收集的全血不再适合用于RNA的研究。

常用的血液保护剂有QIAGEN PAXgene blood tube，PAXgene®血液RNA管内含稳定体内基因转录性状的添加剂，它是通过减少体外RNA降解并将基因诱导减少到最小而发挥作用的。操作流程如下：

血液采集：PAXgene系统提供标准化的BD Vacutainer（真空采血管，室温保存），配合使用一次性消毒采血针作静脉穿刺，采血管内的负压会迫使血液自动吸入管中，当搜集的血液达到2.5毫升刻度线时停止采血。采血管中本身已经预装了6.9毫升的RNA稳定试剂，拔出针头后只要将采血管轻轻颠倒8—10次将二者混匀即可。

将PAXgene®血液RNA管竖直置于室温（18°C到25°C）下贮藏，最短2小时，最长72小时，之后再进行处理或者转移到冷藏箱2°C到8°C或冷冻箱（-20°C）。

6、哺乳动物白细胞的分离方法

在已加入抗凝剂的新鲜全血中加入等体积的PBS（1X），充分混匀；

缓慢转入另一已加入淋巴细胞分离液的离心管中，并使上述混合液处于淋巴细胞分离液液面之上（即两种液体不要混合，保留清晰的界面），3000g离心30min；

用移液器小心分离出白细胞层；用PBS（1X）清洗白细胞，离心收集白细胞，弃上清；

加入白细胞20倍体积的Trizol试剂，用移液器反复吹打至看不到细胞团块，溶液呈澄清而不粘稠的状态；放入-80℃冰箱中长期保存，干冰运输；

7、血浆样本

取出血液样本，对称放于适配器内进行离心，离心后血液分为三层，上层的是血浆，中间的是白细胞层，下层的是红细胞层。

用移液器分别吸取血浆、白细胞层、红细胞至不同的冻存管中。

血浆根据后续的实验要求进行分装，每管样本量为单次实验所需的量为宜，如300-500μL /管，后-80保存。如抽提外泌体，按照1ml/管分装，后-80℃保存。

注意事项：

1. a) 推荐EDTA抗凝处理，尽量避免肝素抗凝血，已有研究报道认为高浓度肝素对后续酶学反应有抑制作用，可能会造成检测失败。
2. b) 分离血浆的过程尽量在冰上操作，以维持血细胞的完整性。
3. c) 整个分离操作应在4小时内完成。

8、血清样本

用血清收集管收集新鲜外周血，室温放置1hr待血液凝固。

将凝固后的新鲜外周血1700g，4°C离心10min，小心收集上层血清，避免触及血凝块。

将收集的血清再用2000g，4°C离心10min，取上清。这一步骤低速离心可以去掉沉淀成分。多管保存，避免多次冻融。

血清根据后续的实验要求进行分装，每管样本量为单次实验所需的量为宜，如300-500μL /管，后-80℃保存。如抽提外泌体，按照1ml/管分装，后-80℃保存。

9、菌体

采用离心或其他方法分离菌和培养基（培养皿培养的菌刮下即可，不要带入培养基）。

收集菌至1.5mL离心管中（建议半管以上，每个样收2管）。弃上清后，用1.0mL PBS（或其他符合要求的缓冲液）溶液洗三遍。

用1ml 1×PBS重悬菌，转移至1.5mL离心管中，离心，弃上清保留沉淀。后加入RNAlater使之菌体充分溶于保存液（可震荡），室温过夜后可转-80℃冰箱保存。 （室温可保存3-5天）

10、石蜡包埋样本

建议提供8-12片左右，10-20μm厚度的石蜡切片。样本时间最好在3年以内，以免样本降解严重。

11、RNA

合作伙伴需提供NanoDrop®、Qubit或者Agilent 2100中的一种形式的样本分析结果：请仔细纯化样品，尽量避免多糖、蛋白质和外切酶的残留，样本必需注明溶剂

12、单细胞样本

基于流式细胞术对单细胞的分选

流式细胞术样品制备大致可分为下面五个步骤：① 取材：取手术或活检组织必须具有代表性，如取手术肿瘤组织，必须取瘤细胞生长旺盛部位；组织等标本必须在取材后保持样本的新鲜；一般在室温1个小时之内处理好样本或及时用固定剂或低温对组织进行保存；② 对细胞的待测生物化学成分进行荧光染色；③ 按照厂家提供的软件程序对样本进行获取、检测和存储；④再依照软件提供的程序对检测结果进行定量分析；⑤ 检测分析结果在生物、医学上的意义进行分析和评价。

物理方法分离单细胞

光学显微镜下通过毛细管虹吸的方法获得单细胞，直接将毛细管折断后裂解在特定介质中。

10X&BD高通量单细胞捕获系统组织样本准备

手术获得新鲜的临床组织样本，切割处理成50-100mg湿重（约绿豆粒大小）每份样本可分装2-3管，必要时建议用生理盐水清洗，已去除样本表面血渍和其他杂质，尽量吸干清洗液后转入1.5ml离心管加入1ml组织保护液保存（保护液4℃保存），该方法理论上最长可保持组织72小时活性），整个操作及样本运输过程在4℃下进行。同城建议泡沫盒装碎冰后打包运输即可。

单个细胞样本的送样要求

单个细胞或小于1000个细胞，细胞分离后加到 8 µl 不含Mg2+和Ca2+的1×PBS溶液中，立刻加入裂解液，并按照公司附带的操作说明进行操作，操作后-70℃或液氮度速冻，干冰运输。若是培养的大量细胞，可以先用不含Mg2+和Ca2+的1×PBS溶液清洗细胞后在加到 8 µl 不含Mg2+和Ca2+的1×PBS溶液中，立刻加入裂解液，并按照公司附带的操作说明进行操作，-70℃或液氮速冻，干冰运输。

13、外泌体：

1.分离试剂推荐使用SBI外泌体分离试剂盒取10ml细胞上清进行处理（也可采用超速离心法取得），分离外泌体后采用抽提试剂进行RNA抽提，通常每10ml细胞上清可得到100-500ng Total RNA总量，按照细胞类型不同得率有所差异。

2.若客户直接提供分离好的外泌体，建议先鉴定其纯度后再送样。外泌体沉淀直接寄送或用充足量TRIzol（700-1000ul）对其进行反复吹打裂解。裂解在TRIzol中的样品，保存转移至-80℃冰箱，干冰运输保存。后采用抽提试剂进行RNA抽提。

运输条件

干冰运输应采用壁厚且质量完好的泡沫箱，材料用编号后的冻存管存放，用塑料袋包装后埋入干冰中，泡沫箱应扣严并用封箱带封严。外套纸壳箱包装，以免碰裂。并标明轻取轻放提示，以保证安全运输。

样品标记：编号尽量简单 1-2-3-4……