大脑是人体最重要的器官，也可能是宇宙间最复杂的物体——结构复杂、功能复杂，比目前规模最大的超级计算机还要复杂无数倍。仅占据我们人体小部分的大脑，包含着千亿个神经元，相互之间还存在着令人难以捉摸的复杂联系，多年来科学家们被她的神秘所吸引。面对如此“精密”的器官，如何高效对其进行多方位研究，一直是科学家们头疼的问题：
01 大众化的方法如免疫标记（immunostaining）或是流式细胞术（flow cytometry, FACS）等虽奏效，但可同时研究的参数却十分有限
02 当在没有特定分子标记的先验知识时，关键的干细胞以及神经祖细胞群会很难分离
03 早期的单细胞RNA测序技术（scRNA-seq）极易受到低细胞数量的限制
我们来看看顶刊中众多研究者们如何运用前沿的技术方法和好的工具平台解决这些问题，高效进行脑科学单细胞研究！

1 人类大脑皮层的发育涉及到神经元的迁移整合。来自美国斯坦福大学的研究团队利用一种3D分化方法，在培养皿中成功诱导神经球（neural spheroid）定向发育成大脑皮层球状体（human cortical spheroids, hCS）以及大脑皮层下球状体（human subpallium spheroids, hSS），并将两者在体外进行组装，以促使细胞迁移和人脑皮质回路的发育。

为全面表征hCS和hSS单细胞的转录组信息，研究人员利用了BD Rhapsody单细胞多组学分析系统，在其分化的第105天将11,838个hCS或hSS结合并酶解成单个细胞，分批进行转录组测序分析。其中，单细胞的捕获方式是通过有限稀释法将单细胞悬浮液随机分布在＞200,000个微孔中得以实现的。后续，研究人员根据BD Rhapsody single-cell whole-transcriptome amplification workflow制备全转录组文库，并利用BD Rhapsody analysis pipeline处理分析数据。通过t分布随机邻域嵌入（tSNE）方法，从hCS或hSS中分离出的细胞聚类显示了两种条件下的分离状况。
组装后的细胞经过电生理测试表明，GABA能和谷氨酸能神经元能够成功形成电路并相互发送信号。这一成果无疑为研究神经发育和疾病以及神经环路等提供了一个有用的模型。

2 为了验证体外诱导分化特异器官上的可靠性，美国斯坦福大学的研究人员于体外培养并诱导12种人类多能干细胞系（hiPSC lines）分化形成hCSs，并利用BD Rhapsody对分化产物进行单细胞转录组分析，以证实该过程的可重复性
 
在分化的第105天，研究人员将三个平行分化为hCS-FF（Feeder-Free condition，无滋养层细胞条件）的hiPSC lines酶解为单个细胞并进行捕获。再通过对BD Rhapsody磁珠进行二次采样，从约67%的捕获细胞中制备全转录组文库，然后进行后续的cDNA合成等操作，并利用BD Rhapsody analysis pipeline处理测序数据，确定细胞标记和分子指数。最后，使用BD Data View 对单细胞转录组谱进行分析，并将当前数据结果与之前于同一平台上获取的hCS-MEF（Mouse Embryonic Fibroblasts，小鼠胚胎成纤维细胞）和hSS单细胞数据进行比较（n=24,237）。
tSNE聚类分析发现，来自hCS和hSS的细胞群聚类揭示了背侧和腹侧分化状态的不同。该研究表明，体外培养神经干细胞的实验方案在不同实验条件、不同干细胞系之间具有良好的重复性，而细胞转录组的差异主要来源于分化时期，并非细胞种系或实验条件。

3 成纤维细胞生长因子21（FGF21）是一种肝脏源激素，可向下丘脑腹内侧（ventromedial hypothalamus，VMH）的谷氨酸能神经元发出信号，以抑制碳水化合物的摄入
 
在此项试验中，来自爱荷华大学医学院和丹麦哥本哈根大学的研究团队充分利用了BD Rhapsody单细胞测序平台，以合理评估哪些细胞能够在下丘脑中表达FGF21的辅助受体KIb（β-klotho）：首先通过BD 流式平台对小鼠下丘脑中的目标单细胞进行筛选，然后将筛选出的细胞加载到BD Rhapsody上捕获单个细胞，并进行cDNA的合成。后续，使用两个定制引物panel生成cDNA文库，该panel由BD设计，分别包含低丰度表达基因和高丰度表达基因。通过该方法以及BD Resolve analysis pipeline，研究人员对活细胞进行了有效的细胞排序、质量过滤和测序数据注释，最终获得了1,904个分类后推定的Klb细胞。随后，运用tSNE分析和无监督聚类，确定了12个神经元和非神经元细胞类型的聚类。
通过这一途径，研究人员得以精确识别下丘脑中的FGF21靶细胞，并揭示了激活谷氨酸能神经元的FGF21信号是介导FGF21诱导的糖抑制和甜味偏好的必要和充分条件。

4 天津医科大学、天津市神经病学研究所刘强教授课题组在此前的文献中报道了脑出血（Perihematomal edema，PHE）后血肿周围脑水肿（intracerebral hemorrhage，ICH）形成的免疫机制
 
实验过程中，研究者使用BD Rhapsody捕获单细胞，并通过BD Rhapsody WTA Amplification Kit构建单细胞RNA-seq文库，采用BD Rhapsody数据分析流程处理测序数据，并利用BD Data View对单细胞转录组谱进行分析，绘制了血液对照组（sham blood）、脑水肿出血组（ICH blood）和脑水肿脑样本（ICH brain sample）中12,443个、8,751个和4,270个自然杀伤（natural killer，NK）细胞的基因表达谱。其中，NK细胞从naive C57BL/6小鼠（BD Bioscience）的脾细胞中分离，经纯化后在FACS Aria III系统上进行两轮细胞分选。
单细胞测序和免疫学研究表明，NK细胞是ICH早期阶段的主要免疫细胞亚群，单细胞转录谱的无偏聚类显示，脑出血后，两个主要的NK细胞亚群分别具有高的细胞毒性或强烈的趋化因子产生特征，与周围的NK细胞相区别。

前沿技术推荐
这么多顶刊中，研究者们都在使用的单细胞多组学技术平台BD Rhapsody，轻松解决以上脑科学研究中存在的技术难题：
1 BD Rhapsody单细胞多组学分析系统是目前唯一可在同一次实验中获得转录组、蛋白组、免疫组库（VDJ）和多样本分析结果的单细胞平台，丰富的多维度参数让脑科学的研究更加深入和全面
2 BD Rhapsody特有的DNA分子标签包含多达88万种细胞标签及约750万种基因标签，能在单细胞水平上，对每个细胞、每个基因同时进行精准标记，高效分离干细胞及神经祖细胞群。
3 相较于早期的低通量单细胞RNA测序方法，BD Rhapsody 具有更高的细胞通量和灵敏度，基于经典的微孔板原理，单次实验可分离100-40000个细胞，同时，该平台对细胞悬液浓度的要求可低至40个/ul，对于脑科学研究中的一些微量样本如脑脊液等也同样适用。
正因为上述技术优点，BD Rhapsody单细胞多组学分析系统已成为「脑/神经」单细胞研究的黄金拍档，帮助科学家们高效探索更多神秘领域
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