可能的原因

解决方法

抗体贮存和操作不当

抗体应保存在 2～8 ℃中，避光保存，同时避免反复冻融

荧光染料淬灭

荧光抗体和荧光抗体染色后的样本都应该避光保存

自发荧光较高

改变抗体的荧光染料形式，避开与自发荧光相同发射光的染料

染色时间和温度不正确

适当调整染色时间和温度

使用错误的染色液染色细胞内蛋白

为了获得最佳细胞内蛋白染色，应该使用正确的缓冲液系统进行细胞固定并破膜，以检测胞浆和细胞核蛋白

分泌性胞内蛋白

流式细胞检测时，细胞因子、趋化因子和生长因子等分泌性蛋白必须保留在细胞内

蛋白质下调，内化或从细胞中被剪切

确定使用的刺激条件不会影响蛋白质定位

蛋白的表达水平过低

对于表达水平过低的抗原，染色时使用最亮的荧光染料，两步法染色有时可以提高敏感性，例如先使用生物素化抗体，再使用荧光结合二级抗体染色

可能的原因

解决方法

自体荧光较高

使用相同刺激条件，但不用任何试剂染色的样本作为细胞自体荧光的对照

抗体与死细胞结合

染色中包含使用活性染料染色，来排除死细胞

Cy5 染料

Cy5 和其它基于青蓝色素的染料，会与特定细胞的 Fc 受体非特异性结合，例如单核细胞和巨噬细胞，考虑使用其它荧光染料

抗体浓度过高

滴定抗体的用量

二级抗体/试剂非特异性结合

滴定二级抗体，使本底降至最低程度，阻断 Fc 受体，确保使用已经被高度认可无非特异性的二级抗体

染色时间太长

根据实验细胞表达，优化抗体浓度和孵育时间

洗涤不充分

增加染色后的洗涤次数

补偿调节不足

利用单染色对照和荧光减一（FMO）对照为每次实验设定补偿

可能的原因

解决方法

使用的同型对照浓度不对

使用与检测抗体浓度相同的同型对照

同型对照来自于不同厂家

使用与实验抗体同一厂家生产的同型对照

分析中包含细胞黏连体或死细胞

单细胞群设门，并使用活性染料，排除黏连体和死细胞

固定/破膜液影响细胞特性

调整 FSC/SSC 电压，使细胞处于可视范围之内

刺激条件改变细胞特性

使用标志物反设门识别细胞，调整 FSC/SSC 电压，使细胞处于可视范围之内