Objectives:In the complex panorama of autoimmune diseases, the characterisation of pivotal contributing autoantibodies that are involved in disease progression remains challenging. This study aimed to employ a global antibody profiling strategy to identify novel antibodies and investigate their association with systemic sclerosis (SSc).

Methods:We implemented this strategy by conducting immunoprecipitation (IP) following on-bead digestion with the sera of patients with SSc or healthy donors, using antigen pools derived from cell lysates. The enriched antigen-antibody complex was proceeded with mass spectrometry (MS)-based quantitative proteomics and over-represented by bioinformatics analysis. The candidate antibodies were then orthogonally validated in two independent groups of patients with SSc. Mice were immunised with the target antigen, which was subsequently evaluated by histological examination and RNA sequencing.

Results:The IP-MS analysis, followed by validation in patients with SSc, revealed a significant elevation in anti-PRMT5 antibodies among patients with SSc. These antibodies exhibited robust diagnostic accuracy in distinguishing SSc from healthy controls and other autoimmune conditions, including systemic lupus erythematosus and Sjögren's syndrome, with an area under the curve ranging from 0.900 to 0.988. The elevation of anti-PRMT5 antibodies was verified in a subsequent independent group with SSc using an additional method, microarray. Notably, 31.11% of patients with SSc exhibited seropositivity for anti-PRMT5 antibodies. Furthermore, the titres of anti-PRMT5 antibodies demonstrated a correlation with the progression or regression trajectory in SSc. PRMT5 immunisation displayed significant inflammation and fibrosis in both the skin and lungs of mice. This was concomitant with the upregulation of multiple proinflammatory and profibrotic pathways, thereby underscoring a potentially pivotal role of anti-PRMT5 antibodies in SSc.

Conclusions:This study has identified anti-PRMT5 antibodies as a novel biomarker for SSc.

本周为大家带来的文献为发表Ann Rheum Dis. (IF: 20.3)的” Identification and validation of anti-protein arginine methyltransferase 5 (PRMT5) antibody as a novel biomarker for systemic sclerosis (SSc)”。本文使用了LabEx提供的Luminex检测服务。

   

  

系统性硬化症（SSc）是一种复杂的自身免疫性疾病，表现为自身免疫、血管病变和广泛的组织纤维化。该疾病涉及多种自身抗体的产生，然而，目前仍缺乏能够有效诊断和评估病情的新型生物标志物。近年来，蛋白精氨酸甲基转移酶5（PRMT5）作为一种关键的酶，因其在多种生理和病理过程中起重要作用，逐渐引起了研究者的关注。本研究旨在鉴定和验证抗PRMT5抗体作为SSc的新型生物标志物，以期为SSc的诊断和治疗提供新的思路。

 

实验方法

患者招募和样本收集：招募了90名系统性硬皮病（SSc）患者、30名系统性红斑狼疮（SLE）患者、8名干燥综合征（SjS）患者和84名健康供体。

   

   

实验流程概述：

1. 样本处理：
• 从SSc患者和健康对照（每组n=3）处获得外周血。
• 血清与由内皮细胞、成纤维细胞、T细胞和单核细胞的细胞裂解液制备的抗原池共同孵育。
2. 抗原-抗体复合物富集：
• 使用蛋白A/G富集抗原-抗体复合物。
• 对复合物进行珠上消化，并通过同位素标签进行标记（iTRAQ）。
3. 定量蛋白组学分析：
• 对这些富集样本进行定量蛋白组学分析，以揭示患者中存在的过度代表性抗体靶标。
• 使用自动化深度肽测序和定量（DEEP SEQ）质谱平台分析免疫沉淀（IP）-质谱（MS）数据，发现可能的自身抗体，但需进一步验证以排除非特异性结合。

（B）抗体验证：

1. 样本处理：
• 从90名SSc患者、30名SLE患者、8名SjS患者和84名健康供体处获得血清进行抗体验证。
2. 抗体检测：
• 通过ELISA检测血清中的抗-PRMT1、抗-PRMT5、抗-HK1和抗-CD5L抗体。
• 确定抗-PRMT5为SSc的特异性自身抗体。
• 通过免疫荧光染色评估SSc皮肤中PRMT5的表达。

（C）抗-PRMT5抗体水平分析：

1. 数据比较：
• 比较健康对照与SSc患者中抗-PRMT5抗体的水平。
• 分析抗-PRMT5抗体水平与SSc患者的临床表型的相关性。

（D）动物实验：

1. 小鼠免疫接种：
• 每两周用重组PRMT5蛋白对小鼠进行皮下注射，共四次。
2. 组织分析：
• 收集皮肤和肺组织进行病理检查和整体RNA测序（RNA-seq）。
• 在PRMT5免疫小鼠中发现皮肤和肺部纤维化，模拟了人类SSc样变化。
• 识别抗-PRMT5抗体为SSc的潜在贡献抗体。

 

   

LabEx提供的Luminex检测服务

使用 Luminex X-MAP 系统定量检测血清中 IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-1beta、IL-13、IL 4、IL-8、IL-10 和 IL-12p70 的浓度（LXLBH10-1/LX MultiDTH-10，LabEx Co.）。
  

   

重要发现

通过应用Deep SEQ蛋白组学平台，研究者总共确认了4798个蛋白，并筛选出了238个富集蛋白质。通过WB和蛋白质互作网络，研究者最后确定了四个目标蛋白：PRMT1, PRMT5, HK-1和CD5L。而在SSc患者中进行的验证显示，SSc患者中抗PRMT5抗体显著升高。因此确定了抗PRMT5抗体是治疗SSc的特异性替代生物标记物。这些抗体在区分SSc与健康对照及其他自身免疫疾病（包括系统性红斑狼疮和干燥综合征）方面表现出强大的诊断准确性，其曲线下面积（AUC）范围为0.900到0.988。值得注意的是，31.11%的SSc患者对抗PRMT5抗体呈现血清阳性。

 

之后研究者进一步证明血清中抗PRMT5抗体水平SSc临床特征的相关性。为了明确抗PRMT5抗体的临床意义，研究者比较了具有一系列临床表型的SSc患者的血清抗体水平。

在皮肤纤维化和肺纤维化患者中，抗PRMT5抗体基线水平均有数值上的升高。同时，血清抗体水平和急性时相反应物、IgG和TIMP-1水平都正相关。此外，研究者还发现，在SSc患者中，抗PRMT5抗体水平与IL-6、肿瘤坏死因子α、IL-10和IL-8的浓度之间存在正相关关系。因此，抗PRMT5抗体的滴度与SSc的进展或缓解轨迹相关联。

 

 

 

热图显示第二验证组SSc患者血清中抗PRMT5抗体水平与细胞因子浓度（pg/ml）之间的相关性（n=42）。

 

为了阐明抗PRMT5抗体对SSc发展的影响，研究者用重组PRMT5蛋白对小鼠进行免疫接种。PRMT5免疫接种显示小鼠皮肤和肺部出现显著的炎症和纤维化，这伴随着多种促炎和促纤维化途径的上调，从而强调了抗PRMT5抗体在SSc中可能具有的重要作用。

本文研究表明抗PRMT5抗体表现为SSc的诊断和预测标志物，以及抗PRMT5抗体的应用可能有助于精确的疾病监测和预后评估。