Despite the identification of driver mutations leading to the initiation of myeloproliferative neoplasms (MPNs), the molecular pathogenesis of MPNs remains incompletely understood. Here, we demonstrate that growth arrest and DNA damage inducible gamma (GADD45g) is expressed at significantly lower levels in patients with MPNs, and JAK2V617F mutation and histone deacetylation contribute to its reduced expression. Downregulation of GADD45g plays a tumor-promoting role in human MPN cells. Gadd45g insufficiency in the murine hematopoietic system alone leads to significantly enhanced growth and self-renewal capacity of myeloid-biased hematopoietic stem cells, and the development of phenotypes resembling MPNs. Mechanistically, the pathogenic role of GADD45g insufficiency is mediated through a cascade of activations of RAC2, PAK1 and PI3K-AKT signaling pathways. These data characterize GADD45g deficiency as a novel pathogenic factor in MPNs.

本周为大家带来的文献为发表于《Gadd45g insufficiency drives the pathogenesis of myeloproliferative neoplasms》（IF:16.6）。本文使用了LabEx提供Luminex多因子检测服务。

该研究揭示了GADD45g基因在骨髓增生性肿瘤（MPNs）中的作用。研究发现生长停滞和DNA损伤诱导γ（GADD45g）在骨髓增殖性肿瘤患者中的表达水平显著降低，而JAK2V617F突变和组蛋白去乙酰化导致了其表达的降低。GADD45g的下调在人类MPN细胞中起着促进肿瘤生长的作用。小鼠造血系统中Gadd45g的缺乏会导致髓系偏型造血干细胞的生长和自我更新能力显著增强，并出现类似MPN的表型。从机理上讲，GADD45g不足的致病作用是通过RAC2、PAK1和PI3K-AKT信号通路的一连串激活介导的。这些数据表明，GADD45g 缺乏是多发性骨髓瘤的一种新型致病因素。

主要发现

GADD45g在多发性骨髓瘤中下调，其低表达在人类多发性骨髓瘤细胞中具有促瘤活性

在骨髓增生性肿瘤（MPNs）患者中，GADD45g基因表达水平显著降低。这一结果来自对ET和PV患者的CD34+和骨髓单个核细胞（BMMNCs）进行的研究，其mRNA和蛋白水平均有所降低。另外，针对PV和PMF患者的CD34+细胞的独立队列研究结果也证实了GADD45g的显著下调。进一步实验表明，MPNs患者中GADD45g水平与其克隆形成能力呈负相关。通过对MPN细胞株HEL和SET-2进行GADD45g表达的基因敲减和过表达实验，发现GADD45g下调显著促进了细胞的克隆形成能力和增殖，抑制了凋亡，并对细胞周期产生了适度影响。总体而言，这些发现表明，GADD45g在MPNs中的异常下调可能作为肿瘤促进因子起作用。

图1 人类 MPNs 细胞中 GADD45g 的表达减少具有促肿瘤功能

缺乏Gadd45g会导致4-6月龄小鼠的血液参数发生畸变

研究发现，在骨髓增生性疾病患者中，GADD45g的表达水平普遍较低，并且通过cBioPortal分析发现，在各种骨髓恶性肿瘤中，包括AML、MPN和MDS等，GADD45g基因突变率极低。因此，为了探究GADD45g在骨髓恶性肿瘤发病机制中的作用，研究人员通过交配Gadd45gflox/flox小鼠与Vav-Cre小鼠，生成了造血系统特异性的Gadd45g杂合（Gadd45g+/−）和纯合（Gadd45g−/−）敲除小鼠模型。研究发现，Gadd45g缺失小鼠的长期造血干细胞（LT-HSCs）具有显著增强的自我更新能力，并出现了异常的血液学参数，包括血浆、骨髓和脾脏中髓系分化偏向以及脾脏明显增大。进一步的流式细胞术分析显示，Gadd45g缺失小鼠骨髓中偏向于髓系的干细胞数量显著增加，而淋巴系干细胞数量保持不变。这些数据表明，Gadd45g的缺失会导致偏向于髓系的干细胞数量和自我更新能力的增强，以及髓系分化偏向，这些现象在小鼠年龄超过4个月后逐渐显现。

图2 Gadd45g 缺乏会导致4-6个月大的小鼠血液学参数失常，并增强造血干细胞的自我更新能力

Gadd45g缺乏会导致小鼠在 10 个月大后出现骨髓增生性肿瘤

研究发现，GADD45g在骨髓增生性肿瘤（MPN）患者中表达水平较低，且在多种髓系恶性肿瘤中几乎不发生基因突变。为探究其在MPN发病机制中的作用，研究团队利用小鼠模型发现，GADD45g缺陷导致骨髓中My-biased HSCs数量和自我更新能力显著增加，进而引发明显的骨髓增生性肿瘤。进一步的实验表明，重新引入GADD45g可延长小鼠的存活时间并减轻疾病症状，证实了其在MPN发展中的重要性。此外，GADD45g缺陷导致的肿瘤发展与体细胞突变无关，提示了其作为MPN治疗靶点的潜力。

图3 Gadd45g 基因缺失会诱发 10 个月大的小鼠出现多发性骨髓瘤

图4 Gadd45g 缺乏诱导的MPN可移植，重新引入Gadd45g可显著延长MPN小鼠的存活期

Gadd45g缺乏症通过激活PI3K-AKT信号通路诱发骨髓增生性肿瘤

研究发现，MPN患者骨髓单个核细胞中GADD45g的中位数mRNA表达水平约为健康个体的两倍降低，与Gadd45g+/−小鼠的降低水平相似。因此，我们选择了Gadd45g+/−小鼠进行后续实验。通过对携带MPN的Gadd45g+/−小鼠与对照小鼠的c-kit+骨髓细胞进行RNA测序分析，发现PI3K-AKT信号通路在Gadd45g缺陷细胞中的上调基因中排名最高。进一步的基因集富集分析进一步确认了该通路的激活。这些RNA测序结果得到了Western blot验证。与小鼠观察结果一致，HEL和SET-2细胞中GADD45g的敲低导致PI3K和AKT的活性增强。进一步的研究表明，AKT激酶抑制剂MK-2206的治疗可以部分逆转Gadd45g缺陷引起的缩短存活时间，WBC计数增加，脾重量增加以及骨髓中My-biased HSCs数量增加等异常。此外，MK-2206治疗也可以完全逆转HEL和SET-2细胞中GADD45g敲低导致的增强的克隆能力和增殖以及凋亡减少。MK-2206的治疗还大大减少了GADD45g低表达MPN患者CD34+细胞中GADD45g表达低组的克隆优势。这些结果表明，PI3K-AKT信号通路的激活介导了Gadd45g不足在MPN中的肿瘤促进作用。

图5 Gadd45g缺乏会诱导PI3K-AKT通路的激活

图6 抑制 PI3K-AKT 通路可消除Gadd45g缺乏对MPN的肿瘤促进作用

Gadd45g缺乏症通过RAC2-PAK1轴诱导PI3K-AKT通路的激活

研究表明，所有的GADD45家族成员都是小、酸性蛋白质，通常通过与其他调节蛋白相互作用发挥功能。通过对野生型小鼠的c-kit+骨髓细胞进行免疫沉淀（IP）结合质谱（MS）筛选，我们发现了RAC2，这是唯一在造血细胞中表达的促进MPNs进展的蛋白质，作为潜在的相互作用蛋白质。通过共免疫沉淀（co-IP）实验证实了GADD45g与RAC2的直接相互作用，并进一步通过明显的GADD45g与RAC2的共定位加以确认。进一步研究发现，Gadd45g的异源缺失导致与RAC2的相互作用明显减少，并且激活的RAC2-GTP水平显著增加。一致的结果在GADD45g敲低的人类MPN细胞系中得到验证。我们的研究显示，GADD45g与RAC2相互作用并抑制其活性，而Gadd45g不足导致GADD45g-RAC2复合物的解离并释放了对RAC2激活的抑制。

图7 RAC2-PAK1通路介导Gadd45g不足诱导的PI3K-AKT激活

PAK是丝氨酸/苏氨酸激酶，是Rho-GTPases家族的主要下游效应蛋白，其中只有PAK1的活化已被证明与MPNs的发病有关。我们进一步研究了GADD45g敲低是否通过RAC2-PAK1通路介导PI3K-AKT的活化。结果显示，Gadd45g缺失显著增强了PAK1的活性。进一步的研究表明，通过慢病毒shRNA下调RAC2不仅大大减少了PAK1和PI3K-AKT的激活，而且逆转了GADD45g敲低导致的HEL和SET-2细胞克隆形成能力增强和凋亡抑制。PAK1抑制剂IPA-3的给予也在这些细胞中产生了类似的效果。与AKT激酶抑制剂MK-2206类似，RAC抑制剂EHT 1864或PAK1抑制剂IPA-3的治疗显著减少了GADD45g低表达MPN患者CD34+细胞中GADD45g表达高组的克隆优势。这些结果表明，Gadd45g不足诱导MPN涉及了一系列信号事件的级联，包括RAC2、PAK1和PI3K-AKT的连续激活。

图8 抑制 RAC2或PAK1可逆转GADD45g缺乏对人类 MPN细胞的肿瘤促进作用

Gadd45g 缺乏会诱导炎症细胞因子的异常产生

研究表明，慢性炎症在MPNs的发病机制中起着关键作用。为了调查Gadd45g不足是否导致细胞因子产生失调，我们使用Luminex (LabEx提供Luminex多因子检测服务)测定了4个月、6个月以及末期Gadd45g+/−小鼠和其年龄相匹配的对照组中几种已被报道在MPNs中具有重要意义的炎症因子的血清浓度。结果显示，在MPN发病后，IL-4、IL-6、CCL3和GM-CSF的水平在Gadd45g+/−小鼠中显著增加，与患者的临床观察结果一致。

此外，为了检验GADD45g的水平是否与细胞因子产生呈负相关，我们同时测量了参与我们GADD45g表达分析的一些MPNs患者的血清细胞因子水平。我们将这些患者分为GADD45ghigh和GADD45glow表达者，并观察到IL-4和IL-6水平在GADD45glow MPNs患者中显著高于其相应的GADD45ghigh对照组。

图9 Gadd45g 缺乏导致炎症细胞因子分泌异常

JAK2V617F突变和组蛋白去乙酰化参与了多发性骨髓瘤中GADD45g的沉默，GADD45g的下调部分介导了多发性骨髓瘤异种移植模型中JAK2V617F的活性

这项研究揭示了几个重要发现。首先，研究发现JAK2V617F突变可导致GADD45g表达下调，而GADD45g减少部分介导了JAK2V617F在MPN中的致病作用。通过体内实验，研究人员发现使用JAK2抑制剂ruxolitinib可显著降低肿瘤负荷，并显著提高BMMNCs中GADD45g的表达水平。此外，在小鼠模型中，GADD45g的下调部分介导了JAK2V617F的致病性。这一发现为MPN的治疗提供了新的靶点，并揭示了GADD45g在疾病发展中的重要作用。

其次，研究发现组蛋白去乙酰化与GADD45g在MPN中的降低表达相关。通过使用选择性HDAC1/2抑制剂Romidepsin，研究人员观察到GADD45g的显著上调，提示组蛋白去乙酰化可能是调控GADD45g表达的重要机制之一。这一发现为治疗MPN提供了新的方向，并为深入理解MPN的病理机制提供了线索。

图10 JAK2V617F突变和组蛋白去乙酰化抑制了GADD45g 的表达，而 GADD45g 的减少在JAK2V617F MPN中起到了促瘤作用。