mRNA vaccines have emerged rapidly in recent years as a prophylactic and therapeutic agent against various diseases including cancer and infectious diseases. Improvements of mRNA vaccines have been underway, among which boosting of efficacy is of great importance. Pam2Cys, a simple synthetic metabolizable lipoamino acid that signals through Toll-like receptor (TLR) 2/6 pathway, eliciting both humoral and cellular adaptive immune responses, is an interesting candidate adjuvant. To investigate the enhancement of the efficacies of mRNA vaccines by Pam2Cys, the adjuvant was incorporated into mRNA-lipid nanoparticles (LNPs) to achieve co-delivery with mRNA. Immunization with the resulting mRNA-LNPs (Pam2Cys) shaped up the immune milieu in the draining lymph nodes (dLNs) through the induction of IL-12 and IL-17, among other cytokines. Antigen presentation was carried out mainly by migratory and dLN-resident conventional type 2 DCs (cDC2s) and significantly more potent antitumor responses were triggered in both prophylactic and therapeutic tumor models in a CD4+ and CD8+ T cell-dependent fashion. Accompanying memory antitumor immunity was also established. Moreover, the vaccine also stimulated much more robust humoral and cellular immunity in a surrogate COVID-19 prophylactic model. Last but not the least, the new vaccines exhibited good preliminary safety profiles in murine models. These facts warrant future development of Pam2Cys-incorporated mRNA vaccines or relevant mRNA therapeutics for clinical application.

本文为对发表于《Signal Transduct Target Ther》的论文“Incorporation of a Toll-like receptor 2/6 agonist potentiates mRNA vaccines against cancer and infectious diseases（掺入 Toll 样受体 2/6 激动剂可增强 mRNA 疫苗对抗癌症和传染病的能力）”的分享，本文使用了LabEx提供的Luminex检测服务，检测了多种细胞因子的表达。

mRNA 疫苗逐渐成为人们关注的焦点，针对 SARS-CoV-2 的 mRNA 疫苗经历了从实验室到临床的快速转变，并在抗击 COVID-19 大流行中做出了突出贡献。

Pam2Cys 是一种简单合成的中性脂肪氨基酸，易于获得和代谢，仅由一个半胱氨酸、一个硫代甘油和两个脂肪酸残基组成。Pam2Cys 及其衍生物通过 TLR2/6 途径发出信号，已被证明可引发体液和细胞适应性免疫反应。它具有亲脂性，高效力等特点，作为一个候选佐剂，具有很强优势。

在这项研究中，Pam2Cys 被整合到 mRNA-LNP 中，以提高 mRNA 疫苗的功效。之后将mRNA用于多种疾病模型中测试，为未来潜在的临床应用提供数据。

研究者先进行了掺入Pam2Cys 的 mRNA 疫苗的制备，获得比常规尺寸更小，具有相似包封效率和良好的多分散性指数。同时在注射部位产生相似水平的靶基因表达，但在肝脏中产生较小程度的靶基因表达水平（图1）。

在肌内给药后的24小时后，研究者通过Luminex测量了dLN中细胞因子水平变化，以此反应疫苗形成的免疫环境（LabEx提供Luminex检测技术服务）。促炎细胞因子（IL-1β和TNF-α）和趋化因子MIP-1β水平显著升高，但同样是促炎症因子的IL-6显著降低。观察到对应的细胞因子水平显著升高，表明疫苗诱导了 Th1 和 Th17 偏向的免疫反应。

通过流式细胞术分析迁移的 cDC2 和驻留cDC2 中的MHC-I 抗原呈递。结果表明，OVA 表位呈递 cDC2 的出现频率高于 cm 疫苗组。此外，疫苗接种引起dLN 中 cDC2 的比例升高，诱导分泌 IL-12 p70和IL-6。

结合以上结果，使用 pm 疫苗进行免疫可以通过诱导 IL-12 和 IL-17 等细胞因子来形成免疫反应，并通过引流淋巴结中的迁移和驻留 cDC2 将抗原有效呈递给 T 细胞。

接下来，OVA pm 疫苗在预防性和治疗性肿瘤模型中进行测试。

治疗环境中的E.G7-OVA肿瘤模型：OVA pm 疫苗组中的小鼠肿瘤50%观察到根除，其他组则是0%。同时，OVA pm 疫苗显著减轻了肿瘤负荷，并提高了小鼠生存率。但在CD4 和 CD8a 基因敲除 (KO) 小鼠中则观察不到OVA pm 疫苗的功效，因此认为疫苗的抗肿瘤效力严重依赖CD4 +和 CD8 + T 细胞免疫。

预防性环境中的E.G7-OVA肿瘤模型：OVA pm 疫苗组中 70% 的小鼠保持无肿瘤状态，相较之下，只有 20% 的OVA cm 疫苗组小鼠保持无肿瘤状态。OVA pm 疫苗组的肿瘤出现明显延迟，负担显著减轻，生存率大大提高。OVA pm 疫苗组免疫后 7 天，循环中OVA 特异性 CD8 + T 细胞的比例显着较高，表明抗原特异性 T 细胞的有效激活和动员。

CT26结肠癌模型：含有20μg CT26新抗原mRNA的pm疫苗可以根除10% 的小鼠体内已形成的肿瘤，延缓了肿瘤生长，并显著提高了生存率。

SARS-CoV-2 刺突疫苗：研究者使用新冠病毒模型来研究pm疫苗引起的体液反应。结果表明，含有SARS-CoV-2 刺突 mRNA 的 pm 疫苗引发显著更高的受体结合域结合IgG滴度和spike protein中和抗体滴度。此外，Spike pm 疫苗组中检测到显著的IFN-γ ⁺ CD8 ⁺ T 细胞和IL-4 ⁺ CD8 ⁺ T细胞和IL-4 ⁺ CD4 ⁺ T细胞。

70 天的随访期间，接种 PM 疫苗的小鼠没有表现出总体特征的改变，例如体重减轻、皮毛皱起、行为等。同时，在pm疫苗免疫后45天，安乐死的小鼠的重要器官，例如心脏、肝脏、脾、肺和肾(图7 )没有组织病理学变化。

文章讨论了如何将 Pam2Cys（一种可通过 Toll 样受体（TLR）2/6 途径发出信号的简单合成代谢脂氨基酸）纳入 mRNA 脂质纳米颗粒（LNPs），以实现与 mRNA 的共同递送。使用由此产生的 mRNA-LNPs （Pam2Cys）进行免疫，可通过诱导 IL-12 和 IL-17 等细胞因子改善引流淋巴结（dLNs）的免疫环境。抗原呈递主要由迁移性和dLN驻留的常规2型DC（cDC2s）进行，在预防性和治疗性肿瘤模型中，CD4+和CD8+T细胞依赖性的抗肿瘤反应明显更强。同时还建立了记忆性抗肿瘤免疫。此外，该疫苗还在代用 COVID-19 预防模型中激发了更强的体液免疫和细胞免疫。文章的结论是，这些事实证明了未来开发 Pam2Cys 嵌体 mRNA 疫苗或相关 mRNA 疗法用于临床应用的必要性。