A: 小备，你好！我现在要做流式实验，样本是人的外周血，接下来我该怎么处理呢？

小乐: 你好，人外周血PBMC的制备流程是：

1. 收集抗凝人外周血，用1640培养基或PBS按照1:1的比例稀释，上下颠倒混匀或者用移液枪吹打混匀。

2. 在15 mL离心管中，先加入3 mL 充分混匀的Ficoll液（1.077密度），再沿着管壁小心加入2 mL稀释后的血液，血液和Ficoll液分层明显为成功。

3. 将样本小心转移到离心机，500 g离心25 min。

4. 小心取出离心管，弃掉上层黄色的液体，吸取中间层的白色薄膜层，即为单个核细胞。

5. 用10 mL PBS洗涤获得的单个核细胞，250 g离心10 min，弃上清。

6. 重复洗涤一次并重悬细胞备用。

A: 那为了确保实验的成功，需要注意些什么呢？

小乐: 根据小备的经验，需要特别注意以下3点：

1. Ficoll使用时的温度很重要，温度太高或者太低都会影响分离效果，Ficoll提前半小时从4℃冰箱取出恢复到室温，温度过高会导致分离不明显，温度过低会导致密度过大，同样分离效果不好，20~25℃最佳。

2. 血液样本最好为新鲜抗凝血（采血2 h 以内），为保持细胞活力，应避免冷冻和冷藏。

3. 50 mL离心管离心效率比15 mL离心管差，为了获得最大量的单核细胞，最好用15 mL离心管，且离心管使用量不要超过三分之一，可以将血样进行等分后加入多个离心管。

A: 好的，我明白了，多谢小备的提醒！

A: 小备，Ficoll分离后的样子是怎样的？

小乐: Ficoll分离后的样子是这样的：

A: 小备描述的好详细啊，谢谢小备！

小乐: 不客气哈！有什么问题欢迎来交流哈。