血液系统恶性肿瘤中不存在所谓的“非物理”肿瘤微环境 (TME) 经常被提及。实体瘤中的 TME 更为复杂，具有物理屏障、多种免疫抑制机制以及多种癌代谢物限制了 CAR T 细胞治疗的疗效。其一为乳酸，与有氧糖酵解有关，TME 中高乳酸水平的存在通常与酸性细胞外 pH 值 (6.5) 以及体外和体内CD8 + T 细胞和自然杀伤 (NK) 细胞的数量和活性较低有关。已显示高乳酸可抑制 T 细胞功能，包括白介素 (IL)-2 分泌和 T 细胞受体的激活。阻断肿瘤细胞中的乳酸脱氢酶 A (LDH-A) 可改善免疫功能和抗程序性细胞死亡 1 (PD-1) 疗法的功效。

研究发现降低肿瘤细胞中的 LDH-A 消除了 T 细胞进入实体瘤的空间限制。

为了增强 T 细胞的靶向性和穿透性。作者研究并成像​了 LDH-A 消耗（LDH-A 短发夹 RNA [shRNA] 敲低 [KD]）对肿瘤代谢和 TME 特定成分对肿瘤生长的影响。以期揭示 第二代 hPSMA CAR 导向 T 细胞疗法的疗效。

使用两种不同的方法来实现 LDH-A KD：一种基于由 Tet 调节 (TRE) 启动子调节的 shRNA，另一种是对 LDH-A 特异的组成型表达的 shRNA。

1、KD 细胞中 LDH-A mRNA 表达、LDH-A 蛋白表达、LDH 酶活性、血管内皮生长因子（VEGF）产生和18 F-氟脱氧葡萄糖（18 F-FDG）摄取显著低于 NC 细胞；

2、体外生长曲线显示 LDH-A KD 细胞的生长比 NC 细胞慢；

3、KD 细胞的氧化磷酸化率高于 NC 细胞；

4、LDH-A KD 细胞比 NC 细胞消耗更少的葡萄糖、产生更少的乳酸。

结果提示：两种系统都显著下调 LDH-A 表达。

确定不同成分占总肿瘤面积的百分比，包括活的肿瘤细胞、基质、出血和坏死+基质胶。

1、NC 肿瘤在肿瘤植入后 12-14 天显示出比 KD 肿瘤更大的 MVD；

2、CD31 +染色密度是肿瘤体积依赖性的并且随着肿瘤体积的增加而降低；

3、KD 中的 CD31 +血管染色低于 NC 肿瘤；

4、血管通透性显示 KD 和 NC 肿瘤之间的摄取没有差异。

1、在标准培养基中孵育 72 小时后，LDH-A KD 中细胞内和细胞外（培养基）的乳酸浓度低于 NC 细胞。；

2、与 KD 细胞相比，NC 的培养基 pH 较低；

3、与小型 KD 肿瘤相比，大型 KD 肿瘤的乳酸水平显著升高。

靶向药物研究

试图确定肿瘤 LDH-A 的消耗和肿瘤乳酸的变化是否会导致 TME 的变化，从而使这些肿瘤更容易接受 CAR T 细胞的递送。用 Plg28z 抗 hPSMA CAR 和串联二聚体红色荧光蛋白 (tdRFP)/ (CB)RLuc 双光学报告基因转导原代人 T 细胞。

1、治疗当天 CAR T 细胞的流式细胞仪分析显示 CAR T 细胞的效应记忆（CCR7 -，CD45RA +）群体占优势。CAR T 细胞的体外扩增在第三周达到顶峰；

2、暴露于高水平乳酸的 CAR T 细胞表现出增殖和扩增减少；

3、与 NC 肿瘤细胞相比，CAR T 细胞对 LDH-A KD 肿瘤细胞的细胞毒性更高；

4、87% 的 T 细胞有抗 hPSMA CAR 表达，67% 的 CAR +T 细胞对 tdRFP/CBRLuc 融合报告基因 (RFP) 呈阳性。

5、在 CAR T 细胞注射后的第 1、2、6 和 8 天，KD 中的平均 BLI 强度比 NC 肿瘤高 2、7、108 和 5 倍​；

结果提示： LDH-A KD 是减少肿瘤生长的主要因素。在存在和不存在 CAR T 细胞治疗的情况下，KD 和 NC 肿瘤之间的肿瘤倍增时间差异显著。

使用MyC-CaP:hPSMA + RLuc-IRES-GFP开发了稳定转染的克隆 (LDH-AK)，以及带有如前所述的乱序 shRNA 的对照 (A5NC) 细胞系。

1、每个细胞的 hPSMA 染色强度在NC 中显著高于 LDH-A KD 肿瘤细胞，hPSMA +细胞的密度也是如此​；

2、随着时间推移在 MyC-CaP hPSMA +肿瘤细胞中观察到的细胞表面 hPSMA 表达丧失​。

 与对照细胞和肿瘤相比，LDH-A 下调显著抑制细胞增殖和皮下肿瘤生长。然而，LDH-A 敲低和对照肿瘤之间的总肿瘤乳酸浓度没有显著差异，这反映了 LDH-A 敲低肿瘤中较低的血管分布、血流和乳酸清除。比较 MyC-CaP 肿瘤与 LDH-A 耗竭和/或抗 hPSMA CAR T 细胞的治疗反应表明，对肿瘤生长的主要影响是 LDH-A 耗竭。使用抗 hPSMA CAR T 细胞治疗时，与肿瘤 LDH-A 消耗相结合，与对照肿瘤生长相比，肿瘤生长显著减缓（p < 0.0001）。

大多数肿瘤都具有需氧糖酵解代谢成分，并且糖酵解产生的乳酸在局部环境中具有免疫抑制作用，如慢性炎症、败血症和自身免疫性疾病等。乳酸抑制细胞毒性 T 细胞增殖和细胞因子产生，导致免疫反应显著降低。通过 LDH-A 的基因缺失降低乳酸水平已被证明可以通过降低 MDSC 的数量和改善 NK 细胞功能来增强免疫反应。

CAR T 细胞动力学的体外监测表明，在乳酸存在的情况下，T 细胞增殖减少和 MyC-CaP:hPSMA +肿瘤细胞细胞毒性降低。

 CAR T 细胞的寿命相对较短。这可以用几个因素来解释：

 (1) 研究中 CAR T 细胞主要由效应记忆 CD8 +群体组成，已知它是离体扩增的 CAR T 细胞的短寿命子集；

(2) 当被抗原阳性肿瘤刺激时，快速分裂的效应记忆 T 细胞经历活化诱导的细胞凋亡；

(3) 随着时间的推移，在体外和体内降低 hPSMA 抗原的细胞表面表达，对 LDH-A KD 的影响比在 NC 细胞和肿瘤中的影响大。

研究结果提示肿瘤代谢和 TME“正常化”的重要性。这些成分（肿瘤代谢、微环境、靶向抗原表达和 CAR T 细胞功能）之间的相互作用有助于癌细胞如何逃避免疫破坏。更好地理解这种关系可能会建立更有效的 CAR T 细胞治疗策略。