单细胞ATAC测序（Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing，ATAC-seq）作为一把的“分子钥匙”，正逐步揭示细胞内部那深不可测的基因调控网络。LabEx可提供 scRNA-seq/scATAC-seq服务，对同一细胞进行全基因组表观基因组分析和转录组联合分析。

一、单细胞ATAC测序是什么？

单细胞ATAC测序，我们首先要理解一个重要概念：染色质。染色质是由DNA和蛋白质组成的结构，是基因在细胞核中的“栖息地”。但是，DNA并不是随时随地都能被读取的。它有时候被紧紧地“打包”起来，处于一种不活跃的状态；而在某些时候，它会变得松散、暴露出来，允许细胞中的分子机器读取其信息。染色质的开放程度，直接影响着基因的表达，如转录因子、增强子等元件的结合和活性，进而影响细胞的功能。

这就引出了ATAC-seq技术（Assay for Transposase-Accessible Chromatin with sequencing），它是一种检测染色质开放状态的方法。简单来说，ATAC-seq能告诉我们在特定细胞中哪些DNA区域是“开放”的，哪些是“关闭”的。更进一步，单细胞ATAC-seq则是在单个细胞水平上检测染色质可及性，这意味着我们可以看到每一个细胞内基因的开关状态，从而揭示不同细胞类型在不同条件下的独特基因表达模式。

二、单细胞ATAC测序的技术原理

那么，这项技术是如何工作的呢？想象一下，我们有一个神奇的小工具，叫做转座酶（transposase），它可以找到那些“暴露”在外的DNA片段，并迅速将一小段DNA序列插入其中。这些插入的片段会作为“标签”，标记出这些开放的DNA区域。

接下来，通过高通量测序，我们就能读取这些被标记的DNA序列，并绘制出染色质开放的“地图”。当我们把这一过程应用于单个细胞时，我们就可以知道每个细胞中的哪些基因是“打开”的，哪些是“关闭”的，这就是单细胞ATAC-seq的基本原理。

这项技术的最大优势在于它的高分辨率。传统的染色质开放性检测方法只能告诉我们一个样本中有多少比例的细胞在某个基因区域是开放的，但单细胞ATAC-seq则可以精确到每个细胞，揭示个体细胞之间的异质性。

三、单细胞ATAC测序的实验流程

单细胞多组学工作流程：

细胞核制备：LabEx可提供新鲜组织单细胞分选、单细胞提核服务。

细胞核捕获：分离单个细胞核，用带有测序接头的 Tn5 转座酶批量标记，在断裂 DNA 的同时将接头插入开放染色质区域。然后将标记的细胞核装入 BD Rhapsody TM微孔板，BD Rhapsody TM 磁珠捕获标记 DNA 片段。

回收测序&生信分析：回收磁珠，对其捕获的片段进行 PCR 扩增以生成测序文库。对文库进行测序，并将测序得到的读数比对到基因组上，以识别单个细胞核中可接近的染色质区域。

Figure（1）scATAC-seq work flow

四、单细胞ATAC测序在肿瘤研究中的应用

北京大学张泽民教授团队结合单细胞 RNAseq、TCR-seq 和 ATAC-seq，收集接受化疗治疗：紫杉醇（11例）vs紫杉醇化疗联合阿替利珠单抗（ PD-L1阻断剂）联合治疗（11例）治疗的共 22位TNBC 患者临床样本。

研究肿瘤微环境和外周血中的免疫细胞动态，揭示应答者和非应答者的免疫特征。文章表明，紫杉醇可以选择性地减少关键的抗肿瘤免疫细胞（CXCL13+ T细胞和相关B细胞），但会增加 TNBC 肿瘤中的免疫抑制性巨噬细胞，使用紫杉醇化疗法减少这些细胞可能会影响联合阿替利珠单抗 (Atezolizumab)进行TNBC治疗的临床结果，表达 CXCL9 的促炎性巨噬细胞与高水平表达CXCL13+ T细胞相关，他们可以耐受紫杉醇方案的有害作用，从而成为免疫应答者，并在联合治疗后进一步提高CXCL13+ T细胞水平。

文章揭示了TNBC患者对于PD-L1阻断剂免疫治疗敏感和耐药的分子机制。

Figure（2） Clinical Features of the patients

本文中使用scATAC-seq测定来检查染色质可及性的变化，并从 5 个样本中获得了 30,758 个免疫细胞的数据。对 scATAC-seq 和单细胞 RNA-seq (scRNA-seq) 数据的综合分析（STAR 方法），鉴定了免疫细胞亚型。

不同亚群的特征基因的染色质可及性证实了它们的细胞身份。

• CD8-CXCL13细胞的表观遗传特征显示 T 细胞耗竭标记物（包括 PDCD1、LAG3 和 CTLA4）峰的特异性富集。
• 与其他 T 细胞亚型的染色质可及性谱相比，CD8-CXCL13细胞 和 CD8+ Tem细胞彼此更加相似，这证实了它们在谱系分化的连续谱中的联系。
• CD8-CXCL13细胞和 CD8+ Tem细胞在 IFNG、GZMK 和 PDCD1 位点中均含有开放染色质区域 (OCR)。 CD8-CXCL13细胞表现出与 CD8+ Tem细胞不同的调控状态， 表现在CXCL13、CTLA4 和 LAYN 中富含 OCR。
• 差异可及峰中过度表达的 TF 结合基序 (TFBM) 也证实了 CD8-CXCL13细胞的表型变化，其中 CREM 和 RBPJ 的 TFBM 倾向于预处理组中富集，而治疗后组中 TBX21、EOMES 和 PRDM1 富集。

因此，染色质可及性动力学揭示的结果与基于转录组的分析结果一致，两者都表明联合治疗后 CD8-CXCL13细胞效应特性的增强。这些结果表明，在 PD-L1 阻断治疗后免疫应答者的患者中诱导了全身免疫反应。

文章转录组和表观遗传数据，联合 TCR 序列研究分析，将为了解晚期 TNBC 不同治疗方案后免疫细胞的功能状态和动态提供丰富的资源。

Figure （3）Functional status and dynamics of immune cells

五、LabEx单细胞ATAC测序技术优势

1. 多组学平台完善：scRNA&AbSeq&scTCR/scBCR&scATAC多组学联合分析
2. 样本制备：成熟的组织样本保存液及细胞悬液制备方法，完美解决组织样本的采集、存储、全国冷链运输和高活性的细胞悬液样本制备
3. 数据分析：建立了完善的单细胞数据处理方法及个性化分析方法和流程