粒细胞是固有免疫系统中的重要细胞之一，嗜酸性粒细胞在白细胞中的比例最少（约1%）。它们起源于骨髓，成熟后储存在外周血中，并迅速迁移到外周组织。在健康小鼠和人类的胃肠道固有层（LP）中，常驻的嗜酸性粒细胞数量最多，对肠道免疫和稳态平衡起着重要作用。嗜酸性粒细胞在组织中的表型、形态和功能等方面表现出显著的多样性。系统地描述嗜酸性粒细胞亚群的组成对于研究相关疾病机制和开发治疗方法都非常必要。

嗜酸性粒细胞相关机制

Human&Mouse造血干细胞到嗜酸性粒细胞的分化途径

嗜酸性粒细胞的特征

①骨髓中成熟的嗜酸性粒细胞

②外周血中活化状态的嗜酸性粒细胞

③ 嗜酸性粒细胞的各种特征

嗜酸性粒细胞实验方法学文章分享

粒细胞是非常脆弱的一群细胞，也是目前很多单细胞RNA测序平台很容易丢失的一类细胞。然而，由于技术上的差异阻止了传统的单细胞RNA测序图谱。

因此，人们对嗜酸性粒细胞的异质性和支持其不同功能的基因调控网络仍然知之甚少。本次分享一篇来自2024年4月份Nature Protocols的文章，该文章从小鼠组织内分离获得嗜酸性粒细胞，并捕获RNA，揭示了不同组织&外周血、骨髓环境中的酸性粒细胞微环境。该文比较了不同富集分离方法及不同单细胞技术对嗜酸性粒细胞的影响，在酸性粒细胞上有何不同效果进行了详细对比。

本周推文中，我们将详细解析一下该文思路及主要发现。

【1】实验思路框架

① 样本采集：骨髓，外周血，脾脏，肠道，肺脏等

② 通过机械、酶消化将组织处理为单细胞悬液，通过梯度密度离心裂红处理外周血和骨髓样本

③ - ④ 通过MACS简介标记的磁珠分选方式，将酸性粒细胞特异性分选

⑤ 通过流式完成分选前后的细胞活性、细胞纯度鉴定

⑥ 通过BD Rhapsody的混样试剂盒，将不同来源样本混合处理

⑦ 通过微孔板完成单细胞分离、RNA捕获、文库制备等

⑧ 测序、数据分析、结果输出

【2】 细胞实验第一步，样本制备铺好路

针对外周血的样本制备，该文提供了详细Ptotocol，并提出了优化步骤：

采集血液，加入梯度密度离心试剂。800g下离心20 min后，将中间层细胞转移到含有PBS的50 mL锥形管中。获得的细胞重悬后并进行红细胞裂解。裂红采用了两种方式，一种是冰蒸馏水（30 s），一种是氯化铵-钾（ACK）缓冲液（3-5 min），都可用于从含有白细胞的样本中去除红细胞。

采集血液，用组织标本进行分层。在800g下处理20 min后，将棕黄色图层（中间层）转移到含有PBS的50 mL锥形管中。获得的细胞颗粒重悬并进行红细胞裂解。冰蒸馏水（30 s）或氯化铵-钾（ACK）缓冲液（3-5 min）可用于从含有白细胞的样本中去除红细胞。

两种方式处理完后，通过流式细胞术检测嗜酸性粒细胞纯度和脱颗粒指标（CD63）。嗜酸性粒细胞圈门策略是：LIVE+CD45+CD11b+MHCII−Ly6G−Siglec-F+

【3】酸性粒细胞的分选方式，MACS or FACS? 该如何选择

本文通过圈门策略容易程度、纯度、细胞压力、Siglec-F获得率、分选时间和RNA quality影响，将MACS和FACS两个方法做了详细对比，因为stress、分选时间因素和 RIN>7选择了MACS磁珠分选方式，使用Siglec-F-PE抗体+Anti PE Microbead间接标记的方式完成分选。

【4】分选的细胞鉴定

【5】单细胞测序

目前绝大部分单细胞测序研究论文中，采用的单细胞平台分为微流控（drop-seq）和微孔板（seqwell）两个大的方向。两种不同的单细胞测序方式，在酸性粒细胞上有何不同效果？该文做了详细对比参数。

结果表明Mircowell技术更适合嗜酸性粒细胞的捕获，具有最小的Shear Sress压力，对细胞更兼容，高质量的RNA捕获（RIN值>7）。而基于微流控技术（Droplet）的单细胞捕获策略Shear Sress较高，RIN值较低<3.5。

【6】酸性粒细胞单细胞测序结果

样本：骨髓，外周血，脾脏，肠道，肺脏，胃部，经过数据处理、过滤和质控，15个细胞分群，5个酸性粒细胞亚群。

嗜酸性粒细胞的典型Marker基因 Siglecf、IL5ra、Ccr3、Epx。

酸性粒细胞亚群基因标记物

 LabEx单细胞测序服务

作为非常脆弱的一类细胞。粒细胞也是目前很多单细胞RNA测序平台很容易丢失的一类细胞。BD Rhapsody单细胞RNA测序技术，基于微孔原理对单细胞进行分离捕获，没有额外的剪切力、试剂的刺激，对细胞更温和，能够高效的捕获各种类型的细胞。

LabEx单细胞转录组+蛋白组助研项目