Pluripotency acquisition in the middle cell layer of callus is required for organ regeneration

植物单细胞研究的难点主要在于细胞壁等因素的限制，BD Rhapsody平台对样本的兼容性非常高，如植物细胞、粒 细胞、海洋生物等都能捕获。

2021年11月15日，中国科学院分子植物科学卓越创新中心徐麟研究组于Nature Plants( IF=15.793 )杂志发表封面文章 "Pluripotency acquisition in the middle cel layer of callus is required for organ regeneration”,翟宁为论文第一作者，研究从单 细胞和分子层面揭示了愈伤组织具有器官再生能力的机制。

单细胞捕获平台: BD Rhapsody单细胞分析系统

样本信息: 拟南芥野生型Col-0、拟南芥双突变体( wox5-1 wox7-1和plt1-21 plt2-21) 诱导产生的愈伤组织

技术手段: 单细胞转录组测序、转录组测序、RT-PCR、免疫共沉淀、酵母双杂交 细胞谱系追踪、生长实验

作者对拟南芥下胚轴(Col0)外植体导产生的愈伤组织进行了单细胞测序，获得了10个细胞族，愈伤组织大致分为 三个细胞层，通过Marker gene鉴定发现，外层细胞(细胞簇和1)特异性表达表皮和根冠的marker基因( PDF1、ATML1 和PIN2等);中层细胞(细胞族2)具有根尖静止中心(QC)的特征(特异性表达PLT1PLT2和WX5等基因 )，拟时序 分析也发现中层细胞可向外层和内层细胞演化;而内层细胞(细胞簇3、4、5)特异性表达TMO5、SMXL3等基因，类似 于根尖的维管初始细胞。

利用特征基因表达模式和细胞谱系追踪等方法，作者发现基因WOX5和PLT1在中层细胞中特异性表达，能在生芽培养 基(SIM)上培养出不定芽的细胞，而在根尖分生组织形成过程中，WOX5的表达逐渐从中间细胞层限制到干细胞生态位表 达，说明愈伤组织中层细胞不仅与QC有着高度类似的转录组特征，也是根和芽再生的源头干细胞。

利用酵母双杂交、免疫共沉淀等技术，作者发现WOX5可直接与基因PLT1/2相互作用。相较于野生型Col0，双突变体 样本的生芽和生根的能力显著降低，TAA1( 内源生长素合成基因可与WX5和PLT1在细胞中共表达，但表达下调。 RNA-seq、RT-qPCR、 ChIP-seq等多技术联合分析发现，器官再生需要WOX5-PLT1/2复合体激活AA1的表达，以促进生长素的积累。

利用RNA-seq、酵母双杂交、免疫共沉淀技术等技术，作者发现WOX5/7抑制了A型ARRs( 细胞分裂素信号途径反应调 节子)和ARR5的表达;此外，WOX5/7-ARR12复合体也可抑制ARR5的表达，从而解除细胞分裂素的负反馈信号通路，促进细胞分裂素反应。

最后作者构建了愈伤组织多能性机制的模型。在分子层面，WOX5/7可能至少通过两种途径促进再生：

(1) wOX5/7与PLT1/2相互作用，激活内源素合成基因TAA1 的表达，以维持高生长素水平。

(2) WOX5/7与ARR12相互作用并抑制ARR5的表达，通过解除细胞分裂素信号传导中的负反馈机制，达到细胞分裂素 超敏感状态。

总的来说，愈伤组织中层细胞通过促进生长素的产生和提高细胞分裂素的敏感性获得多能性，从而促进器官再生。