CD66b^- CD64^dim CD115^- cells in the human bone marrow represent neutrophil-committed progenitors

众所周知，粒细胞是一群非脆的细脑，也是目前很多单细胞RNA测序平台很容易丢失的一类细胞。BD Rhapsodi 单细胞多组学技术，基于微孔和自然沉降原理对单细胞进行分离捕获，无额外压力刺激，对细胞更温和，可实现高通量 高效率捕获。

今天分享的文章是近期发表在Nature Immunology ( IF=20.5 )期的CD66b^- CD64^dim CD115^- cells in the human bone marov represent neutrophil-committed progenitors”，作者通过联合流式和单细胞多组学技术对骨髓CD66b^- CD64^dim CD115^- 的中性 定向祖细胞(neutrophilcommitted progenitorcells ，NPs )进行了系统性研究，结果发现NCPS存在4种处于不同成熟阶段 细胞亚群，且可通过2条不同的分化途径定向分化为CD66b ⁺ 的中性粒细胞。最后通过比较转录组和表型特征发现，NCPs较之前报道的“早期中性粒前体细胞”更为幼稚。

已知粒细胞的发育包含从造血干细胞(hematopoietic stem cels,HSCs)/多能祖细胞( multipotent progenitors，MMPs)-共 同髓系祖细胞( common myeloid progenitors, CMPs)一常规粒巨细胞祖细胞(common granulocyte-marophage progenitors cGMPs)-粒-单核·树突细胞祖细胞(granulocyte-monocyte-dendritic cell progenitors，GMDPs)-早幼粒细胞(promyelocytes PMs)-中幼粒细胞(myelocytes，MYs)-晚幼粒细胞( metamyelocytes，MMs)-状核细胞(band cells，BCs)-分叶核粒细 胞(segmented neutrophils，SNs)-外周成熟中性粒细胞peripheral mature neutrophils，PMNs)等一系列复杂的过程。虽有研 究通过单细胞组学鉴定出人中性粒的各类前体细胞，但这些前体细胞都表达CD66b和CD15，其分化水平更趋近于PMS，而 非更早的祖细胞。此外，有报道在小鼠的CGMPs中鉴定到最早的中性粒祖细胞CD34 ⁺ Ly6C⁺ CD115^- Pro-Neu1s。基于此，作者 拟通过流式和单细胞多组学鉴定人骨髓中的NCPs。

01   BD流式细胞术鉴定GMPs亚群

为了鉴定出比早幼粒细胞更幼稚的中性粒定向祖细胞，采用流式抗体Panel对骨髓中低密度的细胞进行分析，发现 SSC ^lo Lin^- CD45^dim CD10^- CD38⁺ 亚群不同程度地表达CD34和CD45RA，其中CD34⁺ CD45RA⁺ 的亚群也是CD135⁺ 为CGMPs;通过 CD123，CD65和CD115将其进一步细分为5个细胞亚群(1A)

02   体外实验鉴定CD34⁺ CD45RA⁺ CD64^dimCD115^- 亚群为中性粒定向前体细胞

流式分选出该细胞亚群、CMoPs和MDPs，分别进行体外培养。流式分型结果显示CD34⁺ CD45RA⁺ CD64^dim CD115^- 细胞亚群极大部分分化为CD66b+的中性粒细胞，极少数分化为CD14+单核细胞(1B)。

此外，通过表型和形态鉴定，发现CD34⁺ CD45RA⁺ CD64^dim CD115^- 亚群在体外培养7天分化的中性粒细胞大多为幼稚中性 粒细胞(1D，1E)，培养至14天则可完全分化为成熟的中性粒细胞。

以上结果表明，CD34⁺ CD45RA⁺ CD64^dim CD115^- 亚群为中性粒的定向前体细胞。

03   BD流式细胞术鉴定其他NCPS亚群

有研究发现NCA也存在于CD4SRA^- 的亚群中，为此通过BD流式细胞术对低密度的SSC^lo CD45^dim 亚群进行深入分析，发 可通过CD34和CD45RA将CD64^dim CD115^- 的NCPS分为4个亚群

• 1）  NCP1s: CD64^dim CD115^- CD34⁺ CD45RA^-
• 2）  NCP2s: CD64^dim CD115^- CD34⁺ CD45RA⁺ (1和2中介绍)
• 3）  NCP3s: CD64^dim CD115^- CD34^dim/- CD45RA⁺
• 4）  NCP4s: CD64^dim CD115^- CD34^dim/- CD45RA^-

流式分选出以上亚群，并对其形态和发育潜能进行研究，发现CD34^dim 和CD34^dim/- 的NCPS为早幼粒细胞的”上游”细胞 表达不同水平的CD45RA。

04   NCP1s和NCP2s体外培养可独立分化为中性粒细胞

为研究NCPS的发育过程，分选上述4种NCPS分别进行体外培养，流式分析表型，发现NCP1s( CD34⁺ CD45RA^- )可通 下调CD34的表达而直接分化为NCP4s ( CD34^dim/- CD45RA^- );而NCP2S( CD34⁺ CD45RA⁺ )则是先下调CD34的表达分化为NCP3(CD34 ^dim/- CD45RA⁺ )，随后逐步下调CD45RA的表达分化为NCP4，最后都分化为CD66b⁺ 的中性粒细胞(3A，3B)。

01   转录组测序发现NCPs比早幼粒细胞PMs更幼稚

通过Bulk-RNA测序，对NCPs，HSC/MPPS,CMPS,PMs,MYS,MMs,BCs,SNS,PMNs进行转录组特征分析( PCA分析)发现，NCP 的转录水平位于CMPS和PMs之间，且NCPS各亚群之间相互聚集(4A)，其CD34和PTPRC(编码CD45)基因的转录水平也 流式结果一致(4B，4C)。

02   录组测序和表型分析证实NCPs为eNePs，human proNeu1/2s和 COVID-19 proNeus的“上游”细胞

为验证NCPs是否位于最近文章报道的eNePs，human proNeu1/2s和COVID-19 proNeus的“上游”，作者将NCPS PCA基因与 已发表的转录组数据进行比较，发现NCPs比eNePs， human proNeu1/2s和COVID-19 proNeus在转录水平上更为幼稚。且用流 式表型分析验证了此结果。

03   BD单细胞多组学揭示NCPs异质性和发育轨迹

为精确剖析NCPs转录组的异质性，流式分选出NCP1S、 NCP2S、NCP3S、NCP4S和MoPs，混样试剂盒SMK对其分别标记 后，上样BD Rhapsody单细胞平台，最终捕获17902个细胞，其分析结果如下

(1)   从非线性降维UMAP图中可看出，NCPS与CMoPs的转录水平存在明显差异，而NCPs之间分界不明显(7A)。

(2)   Seurat无偏倚聚类分析将细胞亚群分为9个Clusters ( C1-C9 )( 7B )，其中1C4为NCPS亚群(表达中性粒相关 的基因，CEBPE，GFI1，ELANE )，C5-C6则为CMoPs亚群(表达单核细胞相关基因，IRF8，CSF1R，FLT3)(7C)。

(3)   分C1-C4在各NC中的占比发现，NCP1和NCP2s具有相似的C1-C4占比，且以C1为主; NCP3S和NCP4具有 似的C1-C4占比，但以C3为主;此外，C2在各NCPs中的占比基本一致(8A)。

(4)   通过R语言Destuiy函数包计算NCPS中每个细胞的拟时间值( 8B)，并评估他们的成熟程度，结果发现C1亚群 以更幼稚的细胞为主;C3和C4则以较成熟的细胞为主，而C2则介于两者之间( 8C);此外，CD34主要表达于 C1和C2亚群，与NCP1s和NCP2s的表型相吻合(8D)。

(5)   用Seurat对c1-C4的差异基因进行分析，并鉴定出136个关键基因。其中C1高表达未成熟的Marker基因( CD34 TOP2A，TUBB)，C2高表达千扰素刺激基因 ( ISG15，IF116，IFIT3)，而C3和C4则高表达嗜天青颗粒相关基因、中性粒活化和脱颗粒相关基因(8E)。

(6)   通过拟时序评估C1-C4潜在的发育轨迹，发现其存在3条分支，其开始于C1并分化出2种发育轨迹 轨迹1为从C1到C3和C4的分化，其涉及的基因与中性粒细胞颗粒酶相关(TOP2A，CSTG，BEX1)，因此被成为常规发育轨迹”;轨迹2为从C1到C2的分化，其涉及的基因大多为干扰素刺激基因(IFI6，IFITM3，IFIT3)，因 此被成为“干扰素刺激发育轨迹”(8E~8H)

以上数据表明，NCPs存在转录组异质性，且可通过2条不同的分化轨迹进行发育。

在本研究中，作者充分利用流式联合BD Rhapsody单细胞多组学技术优势对骨髓来源的NCPs进行研究，结果发现NCPS 可分为4种处于不同成熟阶段的细胞亚群，并通过2条不同的分化途径定向分化为CD66b”的中性粒细胞，且较之前报道的 早期中性粒前体细胞“更为幼稚。该方法为后续研究其他细胞发育轨迹、异质性和表型等提供了重要的研究思路。