LabEx用BD Celesta（3激光12色）对人PBMC进行Th1/Th2/Th17+Treg9色分群分析实例。                                                                                                                 

整个panel全部为包括表面marker和核内因子，抗体使用量按照厂商推荐。

样本类型：人 PBMC                 仪器：BD Celesta  

流式Panel配色：

实验设置：

实验步骤：

1、细胞刺激

(1) 先将细胞计数，按照 5*10^6 的体积对应 1ml 培养基（1640+10%FBS）放入细胞培养皿中， 培养过夜。

(2) 次日，每个样本中加入 2ul 的刺激抑制剂，培养 7h。 (3) 收集细胞，进行后续流式检测。

2、细胞表面染色

(1) 使用冷的 PBS 缓冲液洗细胞两次，再用 1X PBS 缓冲液制成 1X 10 6 细胞/ml 的悬液。 (2) 设置流式 Blank、补偿对照以及样本管。

(3) 各组依说明书加入适量的 FC block，2-8°C 避光孵育 10 分钟，随后加 1ml PBS 清洗细胞， 离心 3-500g，5min，1ml 重悬。

(4) 各组依说明书加入适量的死活染料，室温避光孵育 15 分钟，离心 3-500g，5min。随后加 1ml Stain Buffer（554656）清洗细胞，离心 3-500g，5min，100 µl 重悬。

(5) 各管依说明书加入适量的细胞表面荧光抗体，2-8°C 避光孵育 30 分钟/常温避光孵育 15 分钟。随后加 1ml PBS 清洗细胞，离心 3-500g，5min。

3、核内因子染色

(1) 表面染色之后，加入 1ml 的 stain Buffer 工作液清洗一次。

(2) 各组加入 1ml 的 TF Fix/Perm Buffer 工作液，4°C 孵育 45 分钟。

(3) 离心弃上清，加入 1ml 的 1 X Perm/Wash Buffer 工作液清洗细胞 2 次，200µl 重悬。 (4) 核内染色，4°C 孵育 30 分钟。 (5) 向管中加入 1ml PBS 清洗细胞，离心 3-500g，5min，400 µl 重悬，3 小时内上流式细胞仪

实验结果

圈门思路

流式Panel现货清单