上次我们为大家初步介绍了类器官的历史、发展和应用方向。在本期文章中，我们将继续深入讨论类器官的世界，了解更多干细胞相关的技术和方法。

类器官主要包括了多能干细胞（Pluripotent Stem Cells，PSC）和成体干细胞（Adult Stem Cells，ASC）衍生的类器官。PSC衍生的类器官通常是发育模型，它们源自可以产生所有三个胚层的 ESC/iPSC。因此这些类型的类器官培养物从中胚层、内胚层或外胚层组织的诱导开始，然后概括从胚胎发育的早期阶段到后期阶段的过程胎儿发育。目前PSC衍生的类器官已经包括了胃、肝、肠、肺和肾，也常被用于感染病研究。

ASC 和 PSC 衍生的类器官可以被视为分别涵盖发育和成人组织状态的互补系统。ASC 衍生的类器官允许研究成人组织维护和修复过程中发生的过程。因此，由于 ASC 只能来源于具有一定再生能力的器官，因此 ASC 衍生的类器官仅存在于有限数量的器官中，基本上所有ASC衍生的类器官类型仅代表器官的上皮部分。ASC被用于开发正常和癌性类器官。

除了ASC和PSC衍生的类器官外，也存在许多其他的创新类器官模型。

皮肤：研究者使用转化生长因子 β (TGFβ) 和成纤维细胞生长因子 (FGF) 信号通路的逐步调节来共同诱导球形细胞聚集体中的颅上皮细胞和神经嵴细胞。在 4-5 个月的潜伏期中，观察到由分层表皮、富含脂肪的真皮和带有皮脂腺的色素毛囊组成的囊肿样皮肤器官的出现（Lee et al., 2020）。

心血管：几项研究建立了PSC衍生的心脏类器官模型，主要模拟心脏发育的早期胚胎阶段，并且在心肌细胞层中形成了空腔，类似人类心脏中胚层观察到的体腔。

泪腺类器官：已有衍生自ASC和PSC的泪腺类器官模型开发。最近的研究发现泪腺类器官可以形成泪管样结构。该类类器官对眼部疾病研究具有重要意义。

脉络丛 (ChP)：脉络丛是大脑内产生脑脊液的上皮屏障结构，因其可以决定哪些物质可以进入脑，因此成为重要的药物靶点。PSC 衍生的 ChP 类器官模型生成了充满液体的上皮隔室，其形态与 ChP 相似并概括了 ChP 功能（Pellegrini et al., 2020）。

类器官培养方法

基质胶法：将干细胞培养于基质胶中，通过化学小分子抑制剂/激活剂、细胞因子、培养基添加剂等物质作用下，通过自我组装、自我分化、自我更新等方式形成的一种类似于人体器官的结构。

悬浮培养法：将干细胞培养于无基质胶的培养基中，通过化学小分子抑制剂/激活剂、细胞因子、培养基添加剂等物质作用下，通过自我组装、自我分化、自我更新等方式形成的一种类似于人体器官的结构。

微流控芯片法：将干细胞培养于微流控芯片中，通过化学小分子抑制剂/激活剂、细胞因子、培养基添加剂等物质作用下，通过自我组装、自我分化、自我更新等方式形成的一种类似于人体器官的结构。

基质胶法类器官构建流程

原代提取

1、试剂准备

2、样本除菌处理

3、样本的剪碎，沉降，消化

4、样本终止、过滤

5、样本基质胶重悬，铺板，加液

类器官传代

1、基质胶重悬

2、离心类器官与基质胶分离

3、添加基质胶重悬铺板

类器官冻存

1、在传代第二步，添加冻存液

2、500个/ml密度冻存，温度梯度降温，-80℃保存

类器官复苏

1、快速解冻

2、添加4°PBS 10ml重悬，轻柔吹打离心

3、弃上清，添加适量PBS重悬将沉淀转移至1.5mlEP管，离心，弃去上清

4、添加200ul基质胶重悬铺板

药敏

1、药物准备阶段（药物种类，浓度）

2、在传代基础上接种到96孔板，加药，拍照。在药物作用第5天检测细胞活性。

Reference：

Lee, J., Rabbani, C. C., Gao, H., Steinhart, M. R., Woodruff, B. M., Pflum, Z. E., Kim, A., Heller, S., Liu, Y., Shipchandler, T. Z., & Koehler, K. R. (2020). Hair-bearing human skin generated entirely from pluripotent stem cells. Nature, 582(7812), 399–404. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2352-3

Pellegrini, L., Bonfio, C., Chadwick, J., Begum, F., Skehel, M., & Lancaster, M. A. (2020). Human CNS barrier-forming organoids with cerebrospinal fluid production. Science (New York, N.Y.), 369(6500), eaaz5626. https://doi.org/10.1126/science.aaz5626